【摘要】：水稻白葉枯病(Bacterial blight,BB)曾被列為水稻的三大病害之一,由黃單胞桿菌水稻變種(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)引起,發(fā)病嚴重時對水稻的品質及產量均危害嚴重。結合水稻的抗病機制研究,運用水稻育種新技術來培育抗性品種,是防治水稻白葉枯病等病害的最有效的辦法。本研究一方面篩選負調控水稻抗性的相關基因,借助CRISPR/Cas9基因編輯技術,在性狀優(yōu)良的水稻品種中進行基因敲除,從而獲得類似于自發(fā)突變的新型材料;另一方面延續(xù)實驗室前期的研究,結合轉錄組數據,對OsWRKY28基因在水稻抗白葉枯病以及褐飛虱中的功能研究進行初步分析。研究的主要內容包括以下幾點:1.運用適用于多靶點的CRISPR/Cas9基因編輯載體,構建了靶向OsPi21和OsBON1基因的CRISPR/Cas9基因編輯載體,經農桿菌介導的水稻遺傳轉化方法獲得了水稻日本晴轉基因植株,檢測并得到了相關轉基因突變材料。在驗證多靶點基因編輯載體的同時,也為應用基礎研究和育種研究拓展了材料。2.對OsWRKY28基因進行啟動子元件分析,在Plant CARE網站上分析后發(fā)現,其含有多個響應激素如MeJA、ABA、GA和IAA等的元件,其中響應MeJA的元件有4個。除此之外,還有響應生物脅迫的TC重復區(qū)域,響應非生物脅迫的低溫應答元件以及類黃酮合成調控元件等。3.定量PCR結果顯示:OsWRKY28基因的表達受MeJA、GA和IAA誘導。OsWRKY28基因由于能夠感受這些激素的變化,且表達受到這些激素的調控,因此推測其可能參與MeJA等介導的抗性信號通路。4.轉錄組結果顯示:OsWRKY28過表達植株與野生型植株相比有1287個基因出現2倍以上差異表達,其中有807個上調,480個下調。OsWRKY28-Cas9轉基因植株中有2293個基因差異表達,包括1594個上調表達基因和699個下調表達基因。這些基因中包括抗病蟲相關調控基因NPRs和OsLecRKs,激素合成相關關鍵基因OsICS、OsLOXs、OsEILs等以及轉錄因子家族基因如OsWRKYs、OsbZIPs、OsNACs等。這些基因的差異表達預示著OsWRKY28可能參與激素介導的抗病蟲害信號調控通路。5.對Dongjing(Oryza sativa Japonica cv.Dongjin,DJ)為背景的T-DNA插入純合突變體水稻植株進行接菌實驗,結果顯示:普通的DJ水稻在接菌14天后的平均病斑長于T-DNA插入突變體水稻株系。對普通的日本晴水稻和以日本晴為背景的OsWRKY28轉基因過表達材料以及CRISPR/Cas9基因敲除轉基因材料進行白葉枯菌接菌實驗,14天后進行病斑統計,統計結果為:OsWRKY28超表達材料病斑長度略高于日本晴,而敲除后的OsWRKY28材料病斑長度略低于超表達材料。兩種材料的接菌抗性鑒定結果相一致,由此證推測OsWRKY28轉錄因子在水稻對白葉枯病的抗性中其負調控作用。6.通過對DJ和DJ為背景的T-DNA插入突變體進行褐飛虱抗性鑒定。初步結果表明:在對14天苗齡的DJ(對照組)和OsWRKY28的T-DNA插入突變體(實驗組)進行接蟲試驗,OsWRKY28的T-DNA插入突變體材料葉片出現葉片萎蔫,整個株型較弱的表型,推測其對褐飛虱的抗性略弱于野生型DJ材料。
【圖文】：

和靶位點二中間缺失了 38 個堿基，這可能是由于 OsPi21-Cas9 設計的兩個離較近，導致兩個靶位點之間的堿基出現大段缺失。除此之外，還有幾株轉為雜合突變，在編輯靶點附近的測序信號出現了雙峰。

一和靶位點二中間缺失了 38 個堿基，這可能是由于 OsPi21-Cas9 設計的兩個距離較近，導致兩個靶位點之間的堿基出現大段缺失。除此之外，，還有幾株轉株為雜合突變，在編輯靶點附近的測序信號出現了雙峰。圖 2.1 Pi21 基因的 CRISPR/Cas9 基因編輯突變模式Figure2.1 CRISPR/Cas9 gene editing mutation pattern of Pi21 gene
【學位授予單位】：浙江師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S435.111.47

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1 何利娟;水稻OsWRKY28基因表達調控途徑分析及其抗白葉枯病機理的探索[D];浙江師范大學;2019年

本文編號：2691277