【摘要】：水稻內(nèi)寄生線蟲(chóng)是水稻重要的病害之一,受線蟲(chóng)侵染的水稻在地上部分通常無(wú)明顯癥狀,但是,水稻線蟲(chóng)會(huì)導(dǎo)致植物生長(zhǎng)速度減慢,特別是在水稻生長(zhǎng)早期,導(dǎo)致水稻的有效分蘗數(shù)明顯減少,植株黃化、矮化,根部變成黃褐色甚至腐爛。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球58%的水稻都受到了潛根線蟲(chóng)的侵染,導(dǎo)致水稻減產(chǎn)25%左右。水稻尖細(xì)潛根線蟲(chóng)(Hirschmanniella mucronata)是內(nèi)寄生線蟲(chóng)的一種,它侵染并寄生在水稻的根部,通過(guò)分泌多種效應(yīng)蛋白來(lái)降解或修飾水稻根部細(xì)胞壁和改變根部細(xì)胞蛋白功能來(lái)達(dá)到侵染和繁殖的目的。同時(shí),水稻為了抵御線蟲(chóng)的侵染也會(huì)主動(dòng)調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝水平,激活細(xì)胞壁修飾酶基因和防衛(wèi)基因的表達(dá),誘導(dǎo)產(chǎn)生植物激素等途徑來(lái)抵抗內(nèi)寄生線蟲(chóng)的侵染。實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,比較分析了接種與不接種尖細(xì)潛根線蟲(chóng)的水稻根部組織差異表達(dá)基因。本實(shí)驗(yàn)從差異表達(dá)基因中選取了OsGWD1基因,通過(guò)克隆該基因并表達(dá)出編碼的蛋白質(zhì)來(lái)尋找與其相互作用的蛋白,為進(jìn)一步探究該基因在水稻與尖細(xì)潛根線蟲(chóng)互作中的作用,以及探索新的潛根線蟲(chóng)防治策略奠定理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1.擴(kuò)增目的基因OsGWD1,利用TA克隆技術(shù)將該基因克隆轉(zhuǎn)化pEASY-T3載體,獲得了重組載體T3:OsGWD1。預(yù)測(cè)分析OsGWD1基因的開(kāi)放閱讀框?yàn)?62 bp,共編碼153個(gè)氨基酸,蛋白分子量大小約為18 KD,等電點(diǎn)(pI)為4.83;屬于親水性不穩(wěn)定蛋白;該蛋白無(wú)信號(hào)肽且不含跨膜結(jié)構(gòu),表明其可能不屬于膜蛋白或分泌蛋白;肽鏈中無(wú)規(guī)則卷曲所占比例較高,具有7個(gè)β片層結(jié)構(gòu);具有高度保守的WD40-repeat結(jié)構(gòu)域,屬于WD40-repeat家族;預(yù)測(cè)與OsGWD1蛋白可能互作的有10個(gè)蛋白并模擬形成了相互作用的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。2.通過(guò)克隆轉(zhuǎn)化得到過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1302:OsGWD1:GFP,亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)目的蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)。利用Gateway技術(shù)將RNAi片段重組至植物干擾載體pB7G,獲得了重組RNAi質(zhì)粒。利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒以及RNAi質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入水稻日本晴獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株,為后續(xù)進(jìn)行水稻潛根線蟲(chóng)接種實(shí)驗(yàn)提供了原材料。3.將OsGWD1的orf序列克隆重組進(jìn)入原核表達(dá)載體中pCzn1中。提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)入含有分子伴侶pTf16的BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,與分子伴侶蛋白共表達(dá)。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分析和Western Blot驗(yàn)證表明成功表達(dá)出了18KD的目的蛋白。0.05 mM的IPTG誘導(dǎo)濃度,16℃誘導(dǎo)表達(dá)20 h為最優(yōu)誘導(dǎo)表達(dá)條件。4.通過(guò)His-tag pull down獲得25個(gè)可能與OsGWD1互作的水稻蛋白。GO分析發(fā)現(xiàn),這些基因共富集在20個(gè)GO條目中,KEGG富集分析表明這些蛋白富集在12條通路中,主要集中在核糖體、氧化磷酸化和吞噬過(guò)程等代謝通路。其中,甘油醛-3-磷酸脫氫酶、S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移酶、熱休克家族蛋白Hsp70、Hsp73和延伸因子蛋白eEF1A在代謝通路中起著關(guān)鍵作用,對(duì)水稻脅迫反應(yīng)及防衛(wèi)反應(yīng)具有重要意義。
【圖文】：

圖 2-1 轉(zhuǎn)膜放置示意圖Fig 2-1 Transfer film placement diagram好的轉(zhuǎn)膜槽放入電泳槽，電泳槽內(nèi)加入轉(zhuǎn)膜緩沖 mA(電壓約 300 V)，轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)蛋白的大小后，將轉(zhuǎn)移完畢的 PVDF 膜用 TBS-T 緩沖液輕入封閉液中過(guò)夜封閉，消除非特異性條帶。封 次，每次 10 分鐘。。按 1: 5000 的稀釋比例用 5 %的脫脂奶粉稀釋稀釋液中，4 ℃冰箱過(guò)夜孵育�？埂壱豢�，用 TBS-T 緩沖液輕搖洗膜，重復(fù) 的稀釋比例用 5 %的脫脂奶粉稀釋，，再將 PVDF育結(jié)束后，加入 TBS-T 緩沖液輕搖洗膜，多重een-20 的目的。 A 液 B 液按 1: 1 混合后，將膜平鋪于保鮮膜上 PVDF 膜上避光反應(yīng) 1 min。在蛋白成像儀中成像并拍照。

圖 2-2 pull down 法獲取互作蛋白Fig 2-1 Pull down assay to obtain interaction protein蛋白功能注釋及分析定到的蛋白進(jìn)行 GO 功能注釋（Gene Ontology）和 genes and genomes）富集分析。GO 數(shù)據(jù)庫(kù)收集了豐富組分（Cell component，CC）、分子功能（MoleculBiological proces，BP）三個(gè)方面，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕虻姆植记闆r。由于生物體通過(guò)調(diào)節(jié)各種基因的不同的基因之間依靠相互作用共同完成生長(zhǎng)代謝過(guò)程、生物化學(xué)及系統(tǒng)功能組學(xué)等方面信息，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)生物現(xiàn)象相關(guān)通路[73]，通過(guò)這些通路可以了解候選基功能，主要參與了哪些生理生化代謝以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途能和闡明相互作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S435.111

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本文編號(hào)：2690872