【摘要】：柑橘黃龍病(Citrus Huanglongbing,HLB)是世界柑橘生產(chǎn)上極具毀滅性的病害。我國至今尚無有效的藥劑可用于根治黃龍病,也未見報(bào)道選育出可靠的抗病品種和砧木,主要以挖除病樹、防控柑橘木虱、使用無病苗木的手段來防控黃龍病。因此,柑橘苗木帶病情況及大田植株感病情況的快速檢測(cè)對(duì)有效防控柑橘黃龍病尤為重要。柑橘黃龍病的檢測(cè)方法主要有常規(guī)PCR、巢式PCR、定量PCR、顯微鏡觀察、血清學(xué)診斷、光譜檢測(cè)等。由于柑橘黃龍病菌具有多樣性,前人報(bào)道的柑橘黃龍病病原菌抗體多數(shù)均只能與相似的抗原結(jié)合,不能廣泛地應(yīng)用于不同區(qū)域、不同品種的柑橘黃龍病檢測(cè)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)相比于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法,更省時(shí)省力,節(jié)約檢測(cè)成本。因此,本論文針對(duì)廣西柑橘黃龍病病原開展了多克隆抗體的研究,同時(shí)建立柑橘黃龍病可視化LAMP體系并對(duì)廣西部分地區(qū)的柑橘苗木和田間植株進(jìn)行黃龍病檢測(cè)。主要研究結(jié)果如下:(1)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中多條柑橘黃龍病病原菌外膜蛋白o(hù)mp基因,設(shè)計(jì)特異引物克隆目的片段并構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a-omp1,將其質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)中進(jìn)行重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。在優(yōu)化后的條件下(添加誘導(dǎo)劑IPTG0.6 mM,在37℃下誘導(dǎo)表達(dá)5 h)誘導(dǎo)得到大量以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白。經(jīng)Western Blot驗(yàn)證,成功獲得約55kDa的重組蛋白。將該重組蛋白進(jìn)行純化(純度≥90%)后作為抗原,制備柑橘黃龍病病菌omp多克隆抗體,最終得到效價(jià)超過1:512 K的多克隆抗體(2)利用PrimerExplorer V5在線軟件在柑橘黃龍病病原菌16SrDNA序列保守區(qū)域的6個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)LAMP引物,對(duì)LAMP反應(yīng)體系與反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化得到Mg2+6 mM,dNTP 1.2 mM,FIP/BIP 1.6 μM,F3/B3 0.2 μM,B.st DNA聚合酶大片段0.24 U/μL,1O×ThermoPol 2.5μL,0.2%Tween-20為最佳反應(yīng)體系,65℃反應(yīng)50 min,80℃滅活7 min為最優(yōu)反應(yīng)條件,添加1μL10倍稀釋的SYBR Green I核酸染料顯色觀察反應(yīng)結(jié)果。建立的LAMP體系僅對(duì)黃龍病基因進(jìn)行擴(kuò)增,特異性高。將感染柑橘黃龍病植株葉脈總DNA倍比稀釋后作為模板檢測(cè)靈敏度,LAMP檢測(cè)下限可達(dá)2.18ng/μL,高于常規(guī)PCR檢測(cè)100倍,與熒光定量PCR相當(dāng)。應(yīng)用常規(guī)PCR和建立的可視化LAMP檢測(cè)方法對(duì)廣西部分地區(qū)的不同品種柑橘苗木和田間植株進(jìn)行黃龍病檢測(cè)。網(wǎng)室培育的25株香橙砧木和25株香橙砧金秋砂糖桔嫁接苗,均未檢測(cè)出柑橘黃龍病菌;田間植株155株,柑橘黃龍病LAMP檢測(cè)方法檢出的陽性率為13.6%,常規(guī)PCR檢測(cè)方法的陽性率為11.6%,常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果為陽性的樣品在LAMP檢測(cè)結(jié)果中均為陽性,建立的LAMP體系可用于廣西柑橘黃龍病田間樣品與苗木的快速檢測(cè)。
【圖文】：

Ａ：正常葉；Ｂ：缺鋅狀黃化；Ｃ：葉脈黃化；Ｄ：均勾黃化；Ｅ：斑駁黃化；Ｆ：枝梢黃化；Ｇ：紅鼻逡逑子果；Ｈ：整株樹黃化逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｓｙｍｐｔｏｍｓ邋ｏｆ邋Ｃｉｔｒｕｓ邋Ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ逡逑Ａ：邋Ｎｏｒｍａｌ邋ｌｅａｆ；邋Ｂ：邋Ｚｉｎｃ邋ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ邋ｙｅｌｌｏｗｉｎｇ；邋Ｃ：邋Ｌｅａｆ邋ｖｅｉｎ邋ｙｅｌｌｏｗｉｎｇ；邋Ｄ：邋Ｕｎｉｆｏｒｍ逡逑ｙｅｌｌｏｗｉｎｇ；邋Ｅ：邋Ｍｏｔｔｌｅｄ邋ｙｅｌｌｏｗｉｎｇ；邋Ｆ：邋Ｓｈｏｏｔ邋ｙｅｌｌｏｗｉｎｇ；邋Ｇ：邋Ｒｅｄ邋ｎｏｓｅ邋ｆｒｕｉｔ；邋Ｈ：邋Ｔｈｅ邋ｗｈｏｌｅ逡逑ｔｒｅｅ邋ｙｅｌｌｏｗｉｎｇ逡逑１．１．３柑橘黃龍病的傳播途徑逡逑柑橘黃龍病短距離傳播主要是通過采用感病的接穗或砧木進(jìn)行嫁接以及柑Ｋｕｗａｙａｍａ）吸食感病植株的汁液后再去取食健康植株的汁播，柑橘木虱是目前報(bào)道黃龍病的唯一傳播蟲媒。此外，黃龍病還可以通過菟絲植株間傳播（柯穗等，１９８６）。長距離的傳播是通過將染病的苗木遠(yuǎn)距離運(yùn)輸域，再通過上述３種途徑進(jìn)行大范圍的擴(kuò)散。目前尚未見有柑橘黃龍病可通過的報(bào)道，也不會(huì)通過汁液摩擦和土壤傳播。逡逑

等于２０００年開發(fā)的一種高效、簡(jiǎn)便、廉價(jià)的核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法。該技術(shù)針對(duì)靶基因的６逡逑個(gè)特定區(qū)域（Ｆ３、Ｆ２、ＦＩ、Ｂ３、Ｂ２、Ｂ１）設(shè)計(jì)４條特異引物，包括兩條外引物（Ｆ３／Ｂ３）逡逑和兩條內(nèi)引物（ＦＩＢ／ＢＩＰ）（如圖１－２），借助具有鏈置換作用的Ｂｓｔ邋ＤＮＡ聚合酶在恒逡逑溫條件下進(jìn)行靶序列高效擴(kuò)增。在ＬＡＭＰ反應(yīng)的過程中析出大量的焦磷酸根離子與反應(yīng)逡逑體系中的Ｍｇ２＋結(jié)合，，形成焦磷酸鎂沉淀，因此，反應(yīng)結(jié)束后可通過肉眼觀察把序列是逡逑否存在，或者借助濁度計(jì)檢測(cè)。也可以通過添加熒光顯色劑來觀察反應(yīng)結(jié)果，常用的熒逡逑光染料有鈣黃綠素（Ｃａｌｃｅｉｎ）、羥基萘酚藍(lán)（ＨＮＢ）、Ｄｙｅ６３、ＳＹＢＲ邋Ｇｒｅｅｎ邋Ｉ。ＬＡＭＰ逡逑的反應(yīng)產(chǎn)物是一系列大小不一的ＤＮＡ片段混合物，因此也可以通過瓊脂糖凝膠電泳檢逡逑測(cè)有無梯狀條帶來判定檢測(cè)結(jié)果。逡逑ＥＥ１逡逑ｆ＞ｒｉ，，ｌｆｒ＼邋Ｆ３Ｃ邋Ｆ２ｃ邋Ｆｉｒ邋Ｔａｒ？ｅＣ邋ＤＮＡ邐Ｒ１邋Ｂ２邋Ｂ３逡逑ｆｖ＝Ｓｓ邋邐Ｓ＝Ｋ邋＝１逡逑Ｆ３邋Ｆ２邋ＦＩ邐Ｂｉｔ邋Ｂ２ｃ邋Ｂ３ｃ邋邐逡逑Ｓ＇邋ｎｍｓ＇邋３３逡逑Ｂ３邋Ｐｒｉｍｅｒ逡逑圖１－２邋ＬＡＭＰ引物設(shè)計(jì)示意圖逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｄｅｓｉｇｎ邋ｏｆＬＡＭＰｐｒｉｍｅｒｓ逡逑（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｎｋｕ．ｂａｉｄｕ．ｃｏｍ／ｖｉｅｗ／０９４ｄｆ３５ａａｄ５邋ｌｆＤ邋ｌｄｃ２８１邋ｆｌ邋ａａ．ｈｔｍｌ）逡逑ＬＡＭＰ技術(shù)的基本原理是：當(dāng)反應(yīng)開始時(shí)，由于上游內(nèi)引物ＨＰ的Ｔｍ值和濃度均逡逑大于上游外引物Ｆ３
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S436.66

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2689647