【摘要】：導(dǎo)致柞蠶患吐白水軟化病的主要病原之一是柞蠶Iflavirus病毒(ApIV),該病毒由單股正鏈小RNA編碼,在其5’端不具有經(jīng)典的帽子結(jié)構(gòu)(m~7GpppN)來完成翻譯起始。該病毒嚴(yán)重危害了柞蠶業(yè)的生產(chǎn),其發(fā)病率可高達(dá)30-70%。因此,研究ApIV病毒的侵染機(jī)制及尋找針對該病毒有效的檢測與防治方法刻不容緩。本研究首先對ApIV的5’端進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,結(jié)果顯示,其上有典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和Y型結(jié)構(gòu)。按照其莖環(huán)結(jié)構(gòu),分別擴(kuò)增得到5個(gè)刪除了不同莖環(huán)的片段。利用雙熒光蛋白報(bào)告基因來驗(yàn)證其內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)功能,并且研究不同莖環(huán)對其IRES活性的影響。通過熒光顯微鏡觀察,酶標(biāo)儀及流式細(xì)胞儀對其熒光進(jìn)行定量,證實(shí)了ApIV 5'端非編碼區(qū)具有非帽子依賴的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)功能,并且莖環(huán)Ⅰ、Ⅳ對其活性影響較大。其次采用生物信息學(xué)的方法,用NPDock分析了各個(gè)莖環(huán)與幾種翻譯起始因子之間的相互作用,對接結(jié)果顯示莖環(huán)Ⅰ、Ⅳ對其活性影響較大,與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。為了建立快速簡潔的ApIV病毒ELISA檢測方法,本研究制備了ApIV病毒特異性多克隆抗體。首先擴(kuò)增ApIV病毒前導(dǎo)蛋白L~(Pro)基因及衣殼蛋白VP3片段,構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET21-L~(Pro)-VP3。經(jīng)對誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度及誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,大量表達(dá)了重組蛋白,以純化后的重組蛋白為免疫原免疫小鼠,制備抗ApIV病毒的多克隆抗體。其次通過對多克隆抗體的效價(jià)、特異性、靈敏度及實(shí)際應(yīng)用檢測,結(jié)果顯示,多克隆抗體的效價(jià)可達(dá)1:25600,能夠與ApIV衣殼蛋白及ApIV病毒發(fā)生特異性反應(yīng),可以檢測到0.4μg的ApIV病毒,并且可以檢測到被ApIV病毒感染的柞蠶。
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S884

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本文編號：2685970