【摘要】：真菌類殺蟲劑是生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)的重要組成部分,是一類寄主譜較廣的蟲生真菌,可通過直接穿透昆蟲體壁殺蟲,具高度特異性、對環(huán)境安全,但由于易受環(huán)境影響而限制其應(yīng)用。因此為克服蟲生真菌的這些缺陷、改良菌株性狀,充分理解蟲生真菌對寄主致病各個環(huán)節(jié)的作用機(jī)理是重要的理論基礎(chǔ)。目前真菌在昆蟲體腔內(nèi)定殖機(jī)理研究發(fā)現(xiàn),昆蟲激素能調(diào)控昆蟲的免疫反應(yīng),但蟲生真菌在血體腔定殖過程與昆蟲激素是否存在直接聯(lián)系尚不明確。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),蛻皮激素和保幼激素能引起蟲生真菌鹿兒島被毛孢表型的變化,激素誘導(dǎo)能顯著增加該菌色素產(chǎn)生和孢外粘液的厚度。本論文根據(jù)昆蟲激素能調(diào)節(jié)被毛孢的孢外粘液分泌這一現(xiàn)象入手,通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)和孢外粘液蛋白表達(dá)譜的聯(lián)合分析,從分子層面解析了鹿兒島被毛孢在寄主體內(nèi)定殖過程中應(yīng)對昆蟲蛻皮激素(20E)和保幼激素(JH)壓力而產(chǎn)生的具體應(yīng)答分子機(jī)理。除了分泌蛋白上調(diào)表達(dá),鹿兒島被毛孢中一些昆蟲激素代謝類基因和凝集素類蛋白也參與應(yīng)答過程。首次從20E誘導(dǎo)產(chǎn)生差異表達(dá)的基因中分離鑒定出1個蛻皮激素失活酶Hsegt基因,并進(jìn)一步研究了該基因的功能。凝集素類蛋白也有參與應(yīng)答過程,從20E處理組分離鑒定一個具有凝血活性的蛋白Hscal1,功能研究表明該蛋白能結(jié)合Ca~(2+)發(fā)揮活性并特異性識別海藻糖。這些主要結(jié)果表明鹿兒島被毛孢與兩種昆蟲激素之間存在直接的相互作用關(guān)系,昆蟲激素也是蟲生真菌在昆蟲體腔定殖時的脅迫壓力之一,為應(yīng)對激素引起的昆蟲生理脅迫,真菌進(jìn)化出了特異性的應(yīng)對策略。論文為探究蟲生真菌在昆蟲體內(nèi)定殖機(jī)制提供了新的線索。所取得的主要研究結(jié)果如下:1.鹿兒島被毛孢應(yīng)答兩種昆蟲激素的分子基礎(chǔ)鹿兒島被毛孢與蛻皮激素和保幼激素存在直接相互作用關(guān)系。模擬家蠶體內(nèi)激素的中濃度水平,將400 ng/mL濃度的蛻皮激素和250 ng/mL的保幼激素對鹿兒島被毛孢進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)后,通過轉(zhuǎn)錄組和蛋白組聯(lián)合分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩種激素誘導(dǎo)下產(chǎn)生的大部分差異基因與寄主互作相關(guān),說明對激素的應(yīng)答是真菌在昆蟲體腔定殖的重要環(huán)節(jié)之一。該菌對20E的應(yīng)答主要集中在脂質(zhì)代謝及氨基糖類代謝等重要生物學(xué)過程;而JH處理組差異表達(dá)基因主要參與了核糖體的合成代謝及蛋白的轉(zhuǎn)錄與翻譯過程。另外胞外分泌蛋白也參與應(yīng)答反應(yīng),兩個處理組共表達(dá)蛋白共有45個,大部分蛋白均上調(diào)表達(dá),這吻合粘液厚度增加的表型現(xiàn)象。鹿兒島被毛孢應(yīng)答昆蟲激素存在特異性的應(yīng)對策略。從轉(zhuǎn)錄組和蛋白譜中共篩選出三類可能對激素有重要應(yīng)答作用的基因:(1)昆蟲激素代謝基因,從差異基因的次級代謝途徑中發(fā)現(xiàn)兩條昆蟲激素代謝相關(guān)途徑,并首次從該菌中篩選出昆蟲激素代謝相關(guān)基因,包括2類蛻皮激素失活酶(EGT和EcKinase)和保幼激素合成途徑中一個關(guān)鍵醛脫氫酶,分別受兩種昆蟲激素的誘導(dǎo)而高表達(dá)。這類基因的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步驗證了蟲生真菌與昆蟲激素之間的直接作用關(guān)系。(2)寄主家蠶高度同源的分泌性蛋白,包括Fibrohexamerin和Sericin 1等絲蛋白,受保幼激素誘導(dǎo)而顯著性高表達(dá),可能與免疫逃避有關(guān);(3)凝集素類蛋白,該菌中一共篩選出4個與激素應(yīng)答相關(guān)凝集素,參與對寄主識別。2.鹿兒島被毛孢胞外粘液成分及對孢子表面性質(zhì)的影響粘液影響孢子粘附和毒力。采用溫和洗脫的方法提取胞外粘液并優(yōu)化提取條件,鹿兒島被毛孢分生孢子粘液蛋白的最優(yōu)提取方法為:孢子濃度在5×10~7conidia/mL左右,2 mM的二硫蘇糖醇(DTT),低溫提取24 h。粘液提取后能顯著影響孢子細(xì)胞表面性質(zhì),使孢子表面疏水性和黏附率下降;同時降低了孢子對大蠟螟和小菜蛾兩種試蟲的毒力。這可能是由于黏液中參與粘附識別、附著胞形成蛋白和昆蟲體壁降解酶被破壞,進(jìn)而導(dǎo)致毒力下降。粘液成分與其功能聯(lián)系緊密。利用Label-free法鑒定正常生長狀態(tài)下孢子的粘液蛋白譜,并與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn),鹿兒島被毛孢的野生型孢外粘液共鑒定出474個蛋白,其中7個與黏附相關(guān)、13個與寄主體壁破壞及附著胞形成相關(guān)、9個與逆境防御機(jī)制相關(guān)。粘液中還含有包括中性糖、堿性糖和堿不溶性糖等糖類,這些糖類可能是以糖-蛋白結(jié)合的方式存在,在昆蟲體腔中與真菌細(xì)胞壁重塑和蛋白糖基化相關(guān)。粘液中含有凝集素類蛋白。采用非變性的方法對鹿兒島被毛孢分生孢子的孢外粘液進(jìn)行提取,粘液粗提物具有凝血活性;進(jìn)一步分離純化,從Sephades G-100分子篩層析中得到一個具有較高凝集活性的蛋白組分Sl(128 unit);SDS-PAGE檢測該組分的分子量為32 KDa。對該組分進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,得到一個Legume-like lectin(HSL)蛋白,具凝集活性。凝集素能夠參與細(xì)胞的識別和粘著,說明粘液也參與寄主識別黏附過程,進(jìn)一步驗證了粘液能影響孢子毒力。3.重要應(yīng)答基因蛻皮激素失活酶Hsegt基因和凝集素蛋白Hscal1的功能研究構(gòu)建了鹿兒島被毛孢遺傳轉(zhuǎn)化體系。篩選出了鹿兒島被毛孢敏感的抗性標(biāo)記:除草劑草銨膦(Phosphinothricin,PPT)和氯嘧磺隆(Chlorimuron ethyl,sur),并確定了PPT對鹿兒島被毛孢的抑制濃度為0.5μL/mL;sur的抑制濃度為150μg/mL。優(yōu)化了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化鹿兒島被毛孢的方法,成功將綠色熒光蛋白和HtA毒力蛋白的過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入該菌野生型菌株并穩(wěn)定表達(dá),基于此方法成功構(gòu)建了鹿兒島被毛孢的遺傳轉(zhuǎn)化體系。Hsegt基因的功能研究。對重要應(yīng)答基因Hsegt進(jìn)行了生物學(xué)功能分析,該基因被注釋為一種蛻皮激素失活酶(Ecdysteroid UDP-glucosyl transferase),屬于egt superfamily,這是首次在蟲生真菌中發(fā)現(xiàn)這類蛻皮激素失活酶。基于鹿兒島被毛孢的遺傳轉(zhuǎn)化體系,獲得了Hsegt基因的敲除(ΔHsegt)、過表達(dá)(OE-Hsegt)及回復(fù)(Comp)菌株。該基因的功能研究表明,Hsegt基因的敲除對菌株的毒力無影響,但超量表達(dá)后增強(qiáng)了菌株的毒力;Hsegt基因過表達(dá)具有20E失活作用,在鹿兒島被毛孢中的上調(diào)表達(dá)能抑制蟲體內(nèi)20E的濃度,同時也能抑制蟲體相關(guān)抗真菌基因的上調(diào)表達(dá)和酚氧化酶活性,進(jìn)一步削弱寄主的免疫反應(yīng),使其體內(nèi)細(xì)菌生長失去平衡、大量繁殖,加速寄主死亡。Hscal1蛋白的功能研究。從轉(zhuǎn)錄組和蛋白組中同時篩選出一個凝集素類蛋白(c7951),對蛻皮激素有特異性響應(yīng)。對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析,該蛋白被注釋為Concanavalin A-like lectin/glucanase,屬于C-Type Lectin家族,具有Ca~(2+)結(jié)合位點(diǎn),將其命名為Hscal1;隨后進(jìn)行體外表達(dá),得到分子量為45.21 kDa的蛋白,該蛋白具有凝血活性,能結(jié)合Ca~(2+)發(fā)揮活性并特異性識別海藻糖,可能參與了真菌在昆蟲體腔內(nèi)的營養(yǎng)識別與代謝。說明凝集素類蛋白參與鹿兒島被毛孢對蛻皮激素的應(yīng)答過程。
【圖文】：

以綠僵菌（Metarhizium）為代表的子囊菌（在生活史上不存段）為例，關(guān)鍵侵染階段包括：感染繁殖體（例如分生孢子和芽孢子主角質(zhì)層的表面；感染結(jié)構(gòu)（附著胞和穿透針）的分化；使用酶和機(jī)械角質(zhì)層；血體腔的定植，克服昆蟲免疫，然后殺死寄主；分生孢子在蟲現(xiàn)并開始下一輪侵染（Butt et al., 2016; Wang et al., 2017）。

且孢梗束質(zhì)地較硬。該菌具有被毛孢屬的典型特征，寄主較大且類群多，生長和產(chǎn)孢相對較快；另外該菌的寄主之一為模式物種——家蠶，其物種遺傳信息完備，便于后續(xù)研究。目前，蟲生真菌致病機(jī)理研究的模式真菌多為球孢白僵菌、金龜子綠僵菌、萊氏野村菌等廣譜類真菌，盡管有很廣的寄主譜，但也存在易產(chǎn)生抗性、特異性不強(qiáng)、遺傳菌株應(yīng)用時轉(zhuǎn)化基因安全問題等。未來專性、窄譜類蟲生真菌可能是生物農(nóng)藥的選擇之一，但目前這類真菌致病機(jī)理研究極少，因此本論文選用鹿兒島被毛孢作為研究材料，擬構(gòu)建窄譜類蟲生真菌的模式物種。昆蟲激素能影響昆蟲免疫反應(yīng)，但目前蟲生真菌與昆蟲激素之間的作用關(guān)系尚不明確。課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，模擬家蠶幼蟲體內(nèi)中高激素水平，固體培養(yǎng)基中加入 250 ng/mL 昆蟲保幼激素和 400 ng/mL 蛻皮激素誘導(dǎo)后，，鹿兒島被毛孢的表型會發(fā)生改變，具體表現(xiàn)為菌落色素分泌增加、孢子外粘液層厚度比對照增加 2-3 倍（圖 2-1）。這個現(xiàn)象說明該菌對昆蟲激素有應(yīng)答作用。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S476


本文編號：2684208