【摘要】：黃曲霉毒素B1(AFB1)、嘔吐毒素(DON)和乙酸肉桂酯(CIA)分別是黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus),禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)和大刀鐮刀菌(Fusarium culmorum),大麗輪枝菌(Verticillium dahlia)等真菌產(chǎn)生的次級代謝物。AFB1和DON極易污染花生和玉米等農(nóng)產(chǎn)品,進而嚴重威脅人畜健康及植物生長。而CIA作為黃萎病菌的致病成分之一,也嚴重影響植物的生長。隔離解毒可有效解決這一問題。植物體內(nèi),腺苷三磷酸結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運蛋白在有毒物質(zhì)解毒過程中具有重要作用,該類蛋白可將有毒物質(zhì)與谷胱甘肽結(jié)合形成的軛合物轉(zhuǎn)運至液泡中儲存或降解,從而降低有毒物質(zhì)對細胞的傷害。然而,ABC轉(zhuǎn)運蛋白與AFB1、DON和CIA解毒之間的聯(lián)系目前尚不清楚。因此,本文以15個擬南芥abcc突變體和來源于黃曲霉及稻瘟病菌的ABC轉(zhuǎn)運蛋白(AfABC和MoMRP)為研究對象,探究了擬南芥ABCC(AtABCCs)、AfABC及MoMRP轉(zhuǎn)運蛋白在提高植物對上述三種真菌毒素耐受性中的作用。主要結(jié)果如下:1.擬南芥ABCC單一突變對AFB1的耐受性影響不明顯經(jīng)AFB1處理后,20個不同插入位點的abcc突變體和野生型擬南芥出現(xiàn)相同程度的根伸長被抑制、子葉白化和真葉發(fā)黃失綠的表型。這些結(jié)果表明,擬南芥ABCC單一突變對AFB1的耐受性影響不明顯。2.表達AfABC和MoMRP提高了擬南芥對黃曲霉毒素的耐受性在擬南芥中組成型表達AfABC和MoMRP,分別用AFB1和黃曲霉粗毒素處理,轉(zhuǎn)基因擬南芥的真葉較野生型大,根也明顯比野生型長。該結(jié)果說明,AfABC和MoMRP增強了擬南芥對黃曲霉毒素耐受性。用AFB1處理AfABC和MoMRP轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥,再轉(zhuǎn)移至不含AFB1的培養(yǎng)基中。檢測結(jié)果顯示,AfABC和MoMRP轉(zhuǎn)基因擬南芥中AFB1的殘留量低于野生型。據(jù)此推測AfABC和MoMRP通過提高擬南芥對黃曲霉素的降解速度,從而提高了其對AFB1的耐受性。3.抑制谷胱甘肽(GSH)合成,AfABC轉(zhuǎn)基因擬南芥對AFB1耐受性下降向培養(yǎng)基中添加谷胱甘肽合成抑制劑BSO(丁硫氨酸亞砜胺)后,AfABC轉(zhuǎn)基因擬南芥對AFB1的耐受性下降。這說明,GSH參與AfABC提高擬南芥對AFB1的耐受性。4.表達AfABC和MoMRP未能提高擬南芥對CIA和DON的耐受性分別用CIA及DON處理擬南芥。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型之間的生長狀態(tài)無明顯差異。說明異源表達AfABC和MoMRP未能提高擬南芥對CIA和DON的耐受性。進一步觀察熒光標記的DON和CIA在根部細胞中的分布和積累,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥根細胞中DON和CIA的分布與野生型無明顯差異。根據(jù)以上結(jié)果推測,AfABC和MoMRP可能不參與DON和CIA向液泡的轉(zhuǎn)運。此外,觀察到的擬南芥abcc突變體中CIA的分布與野生型也無明顯差異。由此推測擬南芥相應(yīng)ABCC轉(zhuǎn)運蛋白可能也不參與CIA向液泡的轉(zhuǎn)運。以上結(jié)果表明,異源表達AfABC和MoMRP能提高擬南芥對黃曲霉毒素的耐受性,不能提高其對DON和CIA的耐受性。AFB1與DON和CIA的轉(zhuǎn)運機制可能不同。
【圖文】：

圖 1.1ABC 轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構(gòu)（Kaspar , 2016）（a）ABC 轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)域排列 （b）NBD 示意圖Figure 1.1 Architecture of ABC transporters (Kaspar , 2016)(a) Domain arrangement of ABC transporters (b) Schematic of a single NBD1.2.2 ABC 蛋白的轉(zhuǎn)運機制ABC 轉(zhuǎn)運蛋白的作用模型包括“ATP 轉(zhuǎn)換模型”、“開關(guān)模型”、“連續(xù)接觸模型”和“往復(fù)式雙通道模型”（Locher, 2016）�！癆TP 轉(zhuǎn)換模型”作用機制分為 3 個時期。第 1 時期，TMD 呈“面向細胞內(nèi)”構(gòu)象，底物與 TMD 中的“口袋”結(jié)合，NBD 連接著 TMD 呈開放式構(gòu)象；第 1時期至第 2 時期，一旦底物被招募，轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)為封閉式構(gòu)象，ATP 與 NBD 結(jié)合，NBD 關(guān)閉；第 2 到第 3 時期，轉(zhuǎn)運蛋白由“面向細胞質(zhì)”構(gòu)象轉(zhuǎn)為“面向細胞外”構(gòu)象，底物被釋放到胞外；最后，轉(zhuǎn)運從第 3 時期回到第 1 時期，NBD 在 ATP 水解和磷酸釋放作用下分開，NBD 的轉(zhuǎn)變傳遞至 TMD，TMD 回到“面向細胞內(nèi)”構(gòu)象（Locher, 2016）�！伴_關(guān)模型”作用機制分為 4 個階段。在第 I 階段，底物與 TMD 內(nèi)部高親和位點結(jié)合，起始轉(zhuǎn)運，NBD 對 ATP 的親和力增強，兩個 ATP 分子共同作用結(jié)合在

圖 1.2ABC 轉(zhuǎn)運蛋白 ATP 轉(zhuǎn)換物質(zhì)運輸模型（Christopher and Higgins, 2004）Figure 1.2 The ATP switch model for the transport cycle of an ABC transporter (ChristoF.H and Higgins K, 2004)NBD 起源不同，不同的 TMD 底物識別位點也有所不同。因此，ABC 蛋白轉(zhuǎn)運機制可能有所不同。因此，以上任意一種模型可能并不能作為解釋所有 A蛋白轉(zhuǎn)運機制的模式。ABC 轉(zhuǎn)運蛋白和 P4-ATPase 均能轉(zhuǎn)運磷脂，，均通過改變轉(zhuǎn)運蛋白構(gòu)象實現(xiàn)脂的跨膜運輸。但二者的轉(zhuǎn)運機制又有所區(qū)別。ABC 轉(zhuǎn)運蛋白主要通過水解 A實現(xiàn) NBD 和 TMD 構(gòu)象改變進而轉(zhuǎn)運磷脂，而 P4-ATPase 主要通過 ATP 驅(qū)動區(qū)保守的天冬氨酸（aspartic acid, Asp）殘基的磷酸化循環(huán)引起 P4-ATPase 構(gòu)象E1 和 E2 之間相互轉(zhuǎn)變進而轉(zhuǎn)運磷脂（Buch-Pedersen et al., 2009; Kühlbrandt, 2001.2.3 ABC 轉(zhuǎn)運蛋白的分類及功能根據(jù) NBDs 的序列相似性，ABC 轉(zhuǎn)運蛋白可分為 ABCA、ABCB、ABCABCD、ABCE、ABCF、ABCG 和 ABCH 八個家族，如圖 1.3。除節(jié)肢動物和斑魚中外，其余生物沒有 ABCH 亞族（Wannes and Thomas, 2014）。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S432.44

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本文編號：2682713