【摘要】：黃曲霉毒素B1(AFB1)、嘔吐毒素(DON)和乙酸肉桂酯(CIA)分別是黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus),禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)和大刀鐮刀菌(Fusarium culmorum),大麗輪枝菌(Verticillium dahlia)等真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝物。AFB1和DON極易污染花生和玉米等農(nóng)產(chǎn)品,進(jìn)而嚴(yán)重威脅人畜健康及植物生長。而CIA作為黃萎病菌的致病成分之一,也嚴(yán)重影響植物的生長。隔離解毒可有效解決這一問題。植物體內(nèi),腺苷三磷酸結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在有毒物質(zhì)解毒過程中具有重要作用,該類蛋白可將有毒物質(zhì)與谷胱甘肽結(jié)合形成的軛合物轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡中儲(chǔ)存或降解,從而降低有毒物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的傷害。然而,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與AFB1、DON和CIA解毒之間的聯(lián)系目前尚不清楚。因此,本文以15個(gè)擬南芥abcc突變體和來源于黃曲霉及稻瘟病菌的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AfABC和MoMRP)為研究對(duì)象,探究了擬南芥ABCC(AtABCCs)、AfABC及MoMRP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在提高植物對(duì)上述三種真菌毒素耐受性中的作用。主要結(jié)果如下:1.擬南芥ABCC單一突變對(duì)AFB1的耐受性影響不明顯經(jīng)AFB1處理后,20個(gè)不同插入位點(diǎn)的abcc突變體和野生型擬南芥出現(xiàn)相同程度的根伸長被抑制、子葉白化和真葉發(fā)黃失綠的表型。這些結(jié)果表明,擬南芥ABCC單一突變對(duì)AFB1的耐受性影響不明顯。2.表達(dá)AfABC和MoMRP提高了擬南芥對(duì)黃曲霉毒素的耐受性在擬南芥中組成型表達(dá)AfABC和MoMRP,分別用AFB1和黃曲霉粗毒素處理,轉(zhuǎn)基因擬南芥的真葉較野生型大,根也明顯比野生型長。該結(jié)果說明,AfABC和MoMRP增強(qiáng)了擬南芥對(duì)黃曲霉毒素耐受性。用AFB1處理AfABC和MoMRP轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥,再轉(zhuǎn)移至不含AFB1的培養(yǎng)基中。檢測結(jié)果顯示,AfABC和MoMRP轉(zhuǎn)基因擬南芥中AFB1的殘留量低于野生型。據(jù)此推測AfABC和MoMRP通過提高擬南芥對(duì)黃曲霉素的降解速度,從而提高了其對(duì)AFB1的耐受性。3.抑制谷胱甘肽(GSH)合成,AfABC轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)AFB1耐受性下降向培養(yǎng)基中添加谷胱甘肽合成抑制劑BSO(丁硫氨酸亞砜胺)后,AfABC轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)AFB1的耐受性下降。這說明,GSH參與AfABC提高擬南芥對(duì)AFB1的耐受性。4.表達(dá)AfABC和MoMRP未能提高擬南芥對(duì)CIA和DON的耐受性分別用CIA及DON處理擬南芥。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型之間的生長狀態(tài)無明顯差異。說明異源表達(dá)AfABC和MoMRP未能提高擬南芥對(duì)CIA和DON的耐受性。進(jìn)一步觀察熒光標(biāo)記的DON和CIA在根部細(xì)胞中的分布和積累,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥根細(xì)胞中DON和CIA的分布與野生型無明顯差異。根據(jù)以上結(jié)果推測,AfABC和MoMRP可能不參與DON和CIA向液泡的轉(zhuǎn)運(yùn)。此外,觀察到的擬南芥abcc突變體中CIA的分布與野生型也無明顯差異。由此推測擬南芥相應(yīng)ABCC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能也不參與CIA向液泡的轉(zhuǎn)運(yùn)。以上結(jié)果表明,異源表達(dá)AfABC和MoMRP能提高擬南芥對(duì)黃曲霉毒素的耐受性,不能提高其對(duì)DON和CIA的耐受性。AFB1與DON和CIA的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制可能不同。
【圖文】：

圖 1.1ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)（Kaspar , 2016）（a）ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域排列 （b）NBD 示意圖Figure 1.1 Architecture of ABC transporters (Kaspar , 2016)(a) Domain arrangement of ABC transporters (b) Schematic of a single NBD1.2.2 ABC 蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用模型包括“ATP 轉(zhuǎn)換模型”、“開關(guān)模型”、“連續(xù)接觸模型”和“往復(fù)式雙通道模型”（Locher, 2016）�！癆TP 轉(zhuǎn)換模型”作用機(jī)制分為 3 個(gè)時(shí)期。第 1 時(shí)期，TMD 呈“面向細(xì)胞內(nèi)”構(gòu)象，底物與 TMD 中的“口袋”結(jié)合，NBD 連接著 TMD 呈開放式構(gòu)象；第 1時(shí)期至第 2 時(shí)期，一旦底物被招募，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)為封閉式構(gòu)象，ATP 與 NBD 結(jié)合，NBD 關(guān)閉；第 2 到第 3 時(shí)期，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由“面向細(xì)胞質(zhì)”構(gòu)象轉(zhuǎn)為“面向細(xì)胞外”構(gòu)象，底物被釋放到胞外；最后，轉(zhuǎn)運(yùn)從第 3 時(shí)期回到第 1 時(shí)期，NBD 在 ATP 水解和磷酸釋放作用下分開，NBD 的轉(zhuǎn)變傳遞至 TMD，TMD 回到“面向細(xì)胞內(nèi)”構(gòu)象（Locher, 2016）�！伴_關(guān)模型”作用機(jī)制分為 4 個(gè)階段。在第 I 階段，底物與 TMD 內(nèi)部高親和位點(diǎn)結(jié)合，起始轉(zhuǎn)運(yùn)，NBD 對(duì) ATP 的親和力增強(qiáng)，兩個(gè) ATP 分子共同作用結(jié)合在

圖 1.2ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 ATP 轉(zhuǎn)換物質(zhì)運(yùn)輸模型（Christopher and Higgins, 2004）Figure 1.2 The ATP switch model for the transport cycle of an ABC transporter (ChristoF.H and Higgins K, 2004)NBD 起源不同，不同的 TMD 底物識(shí)別位點(diǎn)也有所不同。因此，ABC 蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制可能有所不同。因此，以上任意一種模型可能并不能作為解釋所有 A蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的模式。ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和 P4-ATPase 均能轉(zhuǎn)運(yùn)磷脂，，均通過改變轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)象實(shí)現(xiàn)脂的跨膜運(yùn)輸。但二者的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制又有所區(qū)別。ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要通過水解 A實(shí)現(xiàn) NBD 和 TMD 構(gòu)象改變進(jìn)而轉(zhuǎn)運(yùn)磷脂，而 P4-ATPase 主要通過 ATP 驅(qū)動(dòng)區(qū)保守的天冬氨酸（aspartic acid, Asp）殘基的磷酸化循環(huán)引起 P4-ATPase 構(gòu)象E1 和 E2 之間相互轉(zhuǎn)變進(jìn)而轉(zhuǎn)運(yùn)磷脂（Buch-Pedersen et al., 2009; Kühlbrandt, 2001.2.3 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分類及功能根據(jù) NBDs 的序列相似性，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可分為 ABCA、ABCB、ABCABCD、ABCE、ABCF、ABCG 和 ABCH 八個(gè)家族，如圖 1.3。除節(jié)肢動(dòng)物和斑魚中外，其余生物沒有 ABCH 亞族（Wannes and Thomas, 2014）。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S432.44

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本文編號(hào)：2682713