【摘要】：植物生命周期的全過程不可能在完全適宜的環(huán)境條件下進(jìn)行,生物脅迫與非生物脅迫貫穿于植物整個生命周期。轉(zhuǎn)錄因子所介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在植物抵御各種脅迫的反應(yīng)中具有重要功能。AP2/EREBP(APETALA2/ethylene-res ponsive element binding proteins)是一個植物特有的轉(zhuǎn)錄因子超家族,其中ERF類屬于EREBP轉(zhuǎn)錄因子亞族,其主要功能是調(diào)節(jié)植物對激素(乙烯和ABA等)、病原物和非生物逆境脅迫(低溫、干旱及高鹽)等的應(yīng)答反應(yīng)。前期轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)馬鈴薯加湘1號中的一個ERF類轉(zhuǎn)錄因子(PGSC0003DMG400010309)在接種晚疫病菌(Phytophthora infestans)24小時后表達(dá)量顯著上調(diào)。為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)錄因子StPti5的功能,本實(shí)驗(yàn)克隆了編碼StPti5的基因并構(gòu)建了該基因的植物超表達(dá)載體,利用熒光定量的方法分別分析了該基因在生物脅迫(病原菌)和非生物脅迫(高溫、低溫、干旱和高鹽)條件下表達(dá)量的變化情況,主要研究結(jié)果如下:1、基因克隆和序列分析:以馬鈴薯加湘1號為材料,根據(jù)Spud DB Potato Genomics Resource數(shù)據(jù)庫中PGSC0003DMG400010309基因序列設(shè)計(jì)引物,并在引物5’端加上BamHI和SalI酶切位點(diǎn),從加湘1號的RNA中通過RT-PCR擴(kuò)增獲得了加湘1號中的PGSC0003DMG400010309基因,并命名為StPti5,該基因最長開放閱讀框?yàn)?68 bp,編碼含156個氨基酸的蛋白。該蛋白的氨基酸序列生物信息學(xué)分析結(jié)果表明其含有1個典型的AP2結(jié)構(gòu)域,符合ERF類轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征。2、植物表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化:通過酶切、連接將StPti5基因克隆到表達(dá)載體pCAMBIA1301m中。通過測序和酶切驗(yàn)證,證實(shí)StPti5基因成功克隆到表達(dá)載體中,將其命名為p1301m-StPti5。通過凍融法將p1301m-StPti5轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌GV3101中,采用農(nóng)桿菌花序侵染法進(jìn)一步將StPti5基因轉(zhuǎn)化擬南芥,潮霉素平板篩選及PCR檢測得到4株擬南芥陽性植株。3、脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析:分別在接種馬鈴薯晚疫病菌、高溫、低溫、干旱、高鹽的單一脅迫環(huán)境下對馬鈴薯轉(zhuǎn)錄因子StPti5基因進(jìn)行了實(shí)時熒光定量檢測,通過對其相對表達(dá)量的分析發(fā)現(xiàn),在接種馬鈴薯晚疫病菌后,StPti5基因在48h內(nèi)表達(dá)量的變化不明顯,接種后48h-72h期間,表達(dá)量明顯上調(diào);在4℃低溫下,StPti5基因表達(dá)量下調(diào);35℃高溫、150mmol/L Nacl高鹽溶液中和20%PEG模擬干旱處理下,StPti5基因的表達(dá)量先上升后下降。
【圖文】：

圖 1-1ERF 結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)Fig. 1-1 Structure of the ERF domain等植物中，，有很多編碼ERF轉(zhuǎn)錄因子的蛋白，例如，在擬南芥基因組中就已知有122個ERF轉(zhuǎn)錄因子和139個ERF轉(zhuǎn)錄因子（Nakano et al.,類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的順式作用元件一般分為三類：第一類為GCC-box；（DRE: dehydration-responsive element; CRT: C-repeat）；第三類為CC-box，保守序列為AGCCGCC，研究表明其核心序列中的兩個G和的結(jié)合特異性，當(dāng)這3個位點(diǎn)的堿基發(fā)生替換時會導(dǎo)致GCC-box的低，而其它堿基的結(jié)合特性會因互作蛋白的不同而發(fā)生變化（Hao eGCC-box廣泛存在于病程相關(guān)蛋白PR基因的啟動子中，這些基因受控植物生物與非生物脅迫，ABA應(yīng)答、生長發(fā)育等不同信號間的互乙烯應(yīng)答元件。植物的許多抗病相關(guān)基因啟動子都含有GCC-box。現(xiàn)ERF1/2/3能與GCC-box結(jié)合，水稻OsEBP-89也都能與GCC-box結(jié)芥轉(zhuǎn)錄因子AtERF1/2/3/4/5時發(fā)現(xiàn)，AtERF1/2/5對GCC-box比AtERF

圖 1-2 ERF 對生物與非生物脅迫響應(yīng)的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)（Singh et al, 2002)ERF response to biological and abiotic stress regulation networks (Singh e許多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)植物處在低溫、干旱、高鹽等非生物與轉(zhuǎn)錄因子起到重要的作用（如表 1-2）。 如下表中，通過對擬南中已知的一些重要的 ERF 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行克隆并轉(zhuǎn)化受體植物，錄因子在不同脅迫條件下能改變植株對逆境的抵抗，有的通過子，可能激發(fā)一系列的信號途徑，從而使植株既能增強(qiáng)對病原一些非生物逆境的耐受能力。表 1-2 在非生物和生物脅迫中有用的 ERF 基因Table 1-2 ERF genes useful in abiotic and biotic stresses 方法 轉(zhuǎn)基因受體 基因來源 改變的性狀 相關(guān)基因過量表達(dá) 煙草 番茄耐鹽性以及抗低溫能力都得到提升Wu Zhan過量表達(dá) 煙草 番茄抵抗干旱、低溫、高鹽以及高滲透壓的能力大幅提升Wu Wan
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q943.2;S435.32

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2679205