【摘要】：非編碼RNA(ncRNA)是一大類無蛋白編碼能力的RNA的總稱,在基因表達調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用。微小RNA(microRNA,miRNA)與長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是兩大主要類群,它們介導(dǎo)了轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及翻譯等多個層次的基因表達調(diào)控。一些lncRNA可以作為miRNA前體發(fā)揮作用,另外一些lncRNA可以作為miRNA的競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)發(fā)揮作用。本課題在實驗室前期構(gòu)建的家蠶lncRNA文庫的基礎(chǔ)上,選擇兩個lncRNA,一個可以作為miRNA的前體產(chǎn)生多個miRNA,一個與miRNA序列互補作為競爭性內(nèi)源RNA,研究miRNA與lncRNA在家蠶變態(tài)發(fā)育過程中的調(diào)控機制。為利用lncRNA和miRNA對家蠶進行轉(zhuǎn)基因改良提供理論依據(jù)。本課題首先研究了lncRNA、miRNA及miRNA靶基因在家蠶不同發(fā)育時期及不同組織中的表達譜,研究三者之間的互作關(guān)系。其次通過家蠶個體及細胞實驗探索lncRNA通過miRNA參與家蠶變態(tài)發(fā)育的分子機制。主要研究結(jié)果如下:1.lncRNA與miRNA在家蠶變態(tài)發(fā)育過程中的表達譜。以家蠶變態(tài)發(fā)育不同階段的總RNA為研究對象,利用實時熒光定量PCR的方法,研究lncR-6496、lncR-26319、miR-2817和miR-2834在家蠶變態(tài)發(fā)育過程中的表達譜。結(jié)果表明,與miR-2817和miR-2834產(chǎn)生于同一基因座位的lncR-6496與兩個miRNA在家蠶變態(tài)發(fā)育過程中存在著一致的表達趨勢,在幼蟲發(fā)育階段,表達趨勢不明顯;在成蟲及蛹發(fā)育階段,呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。產(chǎn)生于miR-2817和miR-2834互補鏈的lncR-26319與兩個miRNA在家蠶變態(tài)發(fā)育過程中存在著相反的表達趨勢,在幼蟲階段lncR-26319表達量先減少再逐步增加,到5齡時達到最高;兩個miRNA二齡時最高,隨后逐漸下降;在蛹及成蟲階段lncR-26319呈現(xiàn)先上升后下降趨勢,兩個miRNA呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢,表明這些lncRNA可能通過miRNA參與家蠶變態(tài)發(fā)育。2.lncRNA與miRNA在家蠶不同組織中的表達譜。兩個lncRNA和兩個miRNA的趨勢相同,在家蠶的大腦、精巢和中腸中表達量比較高,在馬氏管、絲腺、血淋巴和脂肪中表達量較低。大腦、精巢和中腸是功能和結(jié)果比較復(fù)雜的組織,lncRNA和miRNA在其中可能扮演著重要的角色。3.lncR-26319、miR-2834與靶基因endophilin A在家蠶蛹期表達譜。通過生物信息學(xué)預(yù)測的靶標基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)家蠶內(nèi)吞蛋白endophilin A的3’-UTR與miR-2834的種子序列匹配較好,可能是miR-2834的真實靶標。endophilin A是內(nèi)吞蛋白,在家蠶變態(tài)發(fā)育過程中具有重要的作用,endophilin A基因突變會導(dǎo)致細胞自噬不能正常發(fā)生,自噬是家蠶化蛹過程中的必經(jīng)步驟,自噬功能的缺失將導(dǎo)致家蠶變態(tài)發(fā)育異常。為進一步驗證二者是否存在真實的互作關(guān)系,我們在家蠶蛹期檢測lncR-26319、miR-2834和靶標基因endophilin A的表達譜。結(jié)果顯示,lncR-26319和miR-2834表達趨勢相反,和靶標基因endophilin A表達趨勢一致,均呈現(xiàn)發(fā)育前期低后期高的趨勢,表明lncR-26319可能作為miR-2834海綿抑制miRNA的表達。4.體外實驗驗證miRNA和靶標基因的互作關(guān)系。我們首先構(gòu)建endophilin A3’-UTR的過表達載體psiCHECK-endophilin A。其次,在HEK293細胞系中共轉(zhuǎn)染miR-2834 mimics和psiCHECK-endophilin A,通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測miR-2834和endophilin A的互作關(guān)系。結(jié)果表明,miR-2834過表達可以造成靶標基因psiCHECK-endophilin A的熒光素酶活性降低40%以上,差異極顯著,表明endophilin A是miR-2834的真實靶標。本研究首次發(fā)現(xiàn)miR-2834可以靶向修飾自噬相關(guān)蛋白endophilin A,表明miR-2834可能在家蠶變態(tài)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。該研究結(jié)果為利用miRNA及l(fā)ncRNA參與家蠶變態(tài)發(fā)育提供了良好的前期基礎(chǔ),為家蠶的轉(zhuǎn)基因改良提供了理論依據(jù)。
【圖文】：

lncR-6496 和 lncR-26319 在家蠶變態(tài)發(fā)育過程中表達水平的研究及功能初探第三章 結(jié)果與分析3.1 lncR-6496 及其產(chǎn)生的 miRNA 在家蠶變態(tài)發(fā)育過程的表達譜lncR-6496 是實驗室在前期轉(zhuǎn)錄組測序中獲得的家蠶新的 lncRNA。lncR-6度為 833 個核苷酸，在 lncR-6496 同一基因座位上可以產(chǎn)生兩個 miRNA，miR和 miR-2834。三者位置關(guān)系如圖 1 所示，由圖可見 miR-2734 前體 63 個核苷酸于 lncR-6496 第 386 到 448 位處。miR-2817 前體長度為 66 個核苷酸，位于 lncR第449到514位處。miR-2734和miR-2817之間沒有間隔。成熟的miR-2834和miR產(chǎn)生于其前體序列的 5' 端。

圖 3-2 lncR-6496、miR-2817 和 miR-2834 在家蠶幼蟲期表達量ig 3-2 Expression levels of lncR-6496, miR-2817 and miR-2834 in silkworm、3L2D、4L2D 和 5L3D 分別代表家蠶的一齡 2 d、二齡 2 d、三齡 2 d代表齡期，D 代表天數(shù)。 3L2D, 4L2D and 5L3D respectively represent the first 2 d, the second 2 d and the fifth 3 d of silkworm, L stands for age and d stands for days.蛹期可直接區(qū)分雌雄，，所以我們在家蠶蛹期取了雌雄蛹的 miRNA 的表達譜。在研究的初期我們選取家蠶雌雄化蛹期的果如圖 3-3 所示，由圖可見，lncR-6496 在家蠶的雌蛹中呈現(xiàn)在化蛹 1 天和 5 天時表達量較高，化蛹 2d 出現(xiàn)一個低谷。lnc勢與雌蛹一致。而到達成蟲階段后，雌蛾中 lncR-6496 的表達量表達量則急劇減少。表明 lncR-6496 在家蠶雌雄蛹的變態(tài)發(fā)育但在雌雄蛾中可能發(fā)揮不同的作用機制。lncR-6496產(chǎn)生的兩個miRNA而言，二者表達趨勢與lncR-649
【學(xué)位授予單位】：南陽師范學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S881.2

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1 邱嫵潔;lncR-6496和lncR-26319在家蠶變態(tài)發(fā)育過程中表達譜及功能初探[D];南陽師范學(xué)院;2019年

本文編號：2670199