【摘要】：生長(zhǎng)在自然環(huán)境中的植物,無(wú)時(shí)不刻都在遭受著病原菌和植食性昆蟲的侵害。在長(zhǎng)期的共進(jìn)化和互相選擇的過(guò)程中,植物建立起了一個(gè)復(fù)雜而精密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)去感知和響應(yīng)不同的生物脅迫類型,并迅速的激活植物體內(nèi)相應(yīng)的應(yīng)答路徑,在轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平和代謝水平上建立起新的生理生化平衡。在大田環(huán)境中,多種病蟲害并存,提高植物的廣譜抗性能力才能適應(yīng)復(fù)雜多變的自然環(huán)境。本研究從棉花原生質(zhì)體細(xì)胞壁重建的抑制消減雜交文庫(kù)中克隆了一個(gè)能夠促進(jìn)細(xì)胞壁合成的基因GhLac1,并對(duì)其在介導(dǎo)棉花廣譜抗性中的作用機(jī)制進(jìn)行了研究,取得的主要結(jié)果如下:1.鑒定到受多種處理誘導(dǎo)的漆酶基因GhLac1。通過(guò)對(duì)陸地棉品系YZ1原生質(zhì)體細(xì)胞壁重建的抑制消減雜交文庫(kù)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)了3條與GaLAC1(Gossypium arboretum secretory laccase,GI:40218370)具有較高同源性的EST(expressed sequence tag)序列(GI:213047554,GI:213047555和GI:213047556)。對(duì)這3條EST序列進(jìn)行表達(dá)模式分析,發(fā)現(xiàn)GI:213047556受黃萎病菌、茉莉酸和H_2O_2誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)最為顯著。因此,我們克隆了陸地棉GI:213047556的全長(zhǎng)并命名為GhLac1。GhLac1編碼一個(gè)含有566個(gè)氨基酸的蛋白,且含有植物漆酶典型的銅離子結(jié)合位點(diǎn),以及N端分泌蛋白信號(hào)肽。進(jìn)化分析表明,Gh Lac1與來(lái)源于可可的漆酶TvLac(GI:590604253)相似性最高。組織表達(dá)模式表明GhLac1在根系中表達(dá)量最高,其次是葉片。2.超量表達(dá)GhLac1能夠促進(jìn)木質(zhì)素合成并增強(qiáng)棉花的廣譜抗性。為了驗(yàn)證GhLac1在棉花中的功能,我們構(gòu)建了煙草花葉病毒35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GhLac1超量表達(dá)(35S::GhLac1)和RNAi抑制表達(dá)(35S::RNAi GhLac1)載體,并獲得了相應(yīng)的超量表達(dá)株系(OL-12、OL-13和OL-56)和RNAi抑制表達(dá)株系(iL-1和iL-11)。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),GhLac1超量表達(dá)材料中木質(zhì)素含量增加,這與已報(bào)道的植物漆酶能夠促進(jìn)木質(zhì)素單體聚合的功能相吻合。抗性鑒定表明,超量表達(dá)GhLac1提高了轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)黃萎病菌、棉鈴蟲和棉蚜的抗性。3.抑制GhLac1表達(dá)能夠促進(jìn)棉花黃酮類次生代謝物及茉莉酸合成并增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因材料對(duì)黃萎病菌和棉鈴蟲的抗性。在抑制GhLac1表達(dá)后,轉(zhuǎn)基因材料的木質(zhì)素含量減少,但是苯丙烷代謝路徑上游基因的表達(dá)水平和蛋白酶活明顯增加。后續(xù)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了,在GhLac1抑制表達(dá)材料中總黃酮的含量增加,并具有抑制黃萎病菌和棉鈴蟲生長(zhǎng)的作用。此外,我們還發(fā)現(xiàn)在GhLac1抑制表達(dá)材料中,茉莉酸和茉莉酸異亮氨酸含量增加,茉莉酸介導(dǎo)的信號(hào)路徑組成性激活。因此,抑制GhLac1表達(dá)增強(qiáng)棉花對(duì)黃萎病菌和棉鈴蟲抗性增強(qiáng)可能與黃酮等次生代謝物的積累和茉莉酸信號(hào)路徑的組成性激活有關(guān)。4.抑制GhLac1表達(dá)導(dǎo)致棉花對(duì)棉蚜的敏感性。對(duì)GhLac1抑制表達(dá)材料進(jìn)行蚜蟲接種鑒定,結(jié)果表明,與對(duì)照材料相比,轉(zhuǎn)基因材料更感蚜蟲。這可能是由于抑制GhLac1表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因材料中木質(zhì)素含量減少,有利于蚜蟲口器的刺入,方便蚜蟲的取食;此外,在GhLac1抑制表達(dá)材料中,由于茉莉酸信號(hào)路徑組成性激活間接抑制了在抗蚜蟲中具有重要作用的水楊酸信號(hào)路徑,因而導(dǎo)致GhLac1抑制表達(dá)材料更感蚜蟲。5.GhLac1抑制表達(dá)材料中茉莉酸含量增加依賴于細(xì)胞壁多糖含量的增加。病原菌入侵或植食性昆蟲取食造傷的細(xì)胞壁損傷,會(huì)造成胞壁區(qū)間內(nèi)細(xì)胞壁多糖含量的增加,而位于細(xì)胞膜上的相關(guān)受體能夠識(shí)別這種多糖信號(hào)并激活植物免疫系統(tǒng)。細(xì)胞壁多糖含量測(cè)定表明,與對(duì)照材料相比,GhLac1抑制表達(dá)材料中水溶性和EDTA溶解性細(xì)胞壁多糖含量最高,而GhLac1超量表達(dá)材料中含量最低。用轉(zhuǎn)基因材料和對(duì)照材料的水溶性細(xì)胞壁多糖處理棉花懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系,也證實(shí)了這種水溶性多糖能夠促進(jìn)茉莉酸的合成,且茉莉酸的含量和處理時(shí)所用水溶性多糖含量正相關(guān)。因此,我們推測(cè)GhLac1抑制表達(dá)材料中茉莉酸含量增加是由于木質(zhì)素含量減少,細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)松弛,導(dǎo)致水溶性和EDTA溶解性細(xì)胞壁多糖含量增加并激活了植物體內(nèi)茉莉酸合成路徑。
【圖文】：

并且兼顧了對(duì)病原微生物抗性的廣譜性和�；�。廣義上，植物 原 物 的 抗 性 可 分 為 非 寄 主 抗 性 和 寄 主 抗 性 (Lipka et al., 20eimer-Michalski et al., 2016)。非寄主抗性是植物的主要抗病類型，具有廣譜定持久的特點(diǎn)，不易隨著病原微生物的進(jìn)化變異而喪失，這也是為什么自然雖然存在著大量的病原微生物，，植物只對(duì)少部分的微生物表現(xiàn)出敏感性的原Gill et al., 2015; Lee et al., 2017; Mysore et al., 2004)。相對(duì)于非寄主抗性，人們的更多的是寄主抗性，從植物如何感知病原物的入侵，如何激活并放大植物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，到如何積累物理的、化學(xué)的抗性物質(zhì)都進(jìn)行了深入的研究。在與病原微生物長(zhǎng)期的共進(jìn)化中，植物形成了 2 個(gè)層面上的免疫反應(yīng)：一是病關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern, PAMP）或者損傷相關(guān)分 式 （ damage-associated molecular pattern, DAMP ） 誘 發(fā) 的 免 疫 反Pattern-triggered immunity）PTI；另外一個(gè)是效應(yīng)子（effector）誘發(fā)的免疫（effector-triggered immunity）ETI（圖 1.1）(Dodds et al., 2010; Xu et al., 2017

圖 1.2 常見的植物模式識(shí)別受體模型（引自 Macho et al., 2014）。Fig. 1.2 Various types of plasma membrane localized pattern recognition proteins (Macho et al.,2014).在植物與病原物協(xié)同進(jìn)化的過(guò)程中，病原菌為了突破植物的 PTI 免疫達(dá)到入侵植物的目的，會(huì)進(jìn)化出一類致病能力更強(qiáng)的效應(yīng)子，這些效應(yīng)子能夠干擾植物的 PTI 反應(yīng)，從而抑制植物的基礎(chǔ)免疫。植物為了突破病原微生物效應(yīng)子導(dǎo)致的免疫抑制，會(huì)進(jìn)一步進(jìn)化出針對(duì)特定效應(yīng)子的 R 基因（resistance gene），隨后病原菌也會(huì)進(jìn)化出新的效應(yīng)子突破植物的免疫反應(yīng)，如此循環(huán)。這也是目前所公認(rèn)的植物與病原物共進(jìn)化的‘zigzag’模型（圖 1.3）(Jones et al., 2006)。R 蛋白能夠識(shí)別病原微生物的效應(yīng)蛋白，從而激活下游的 ETI 反應(yīng)，同時(shí)伴隨著超敏反應(yīng)（hypersensitive reaction）的產(chǎn)生，在侵染部位造成局部性細(xì)胞壞死以限制病原菌的擴(kuò)展。因此，相對(duì)于 PTI，ETI 反應(yīng)更加迅速和特異，反應(yīng)也更為劇烈，類
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S435.62

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本文編號(hào)：2666345