【摘要】：作為固著生長(zhǎng)的植物,不可避免的會(huì)遭遇到各種環(huán)境脅迫的影響。環(huán)境脅迫通常分為生物脅迫和非生物脅迫,前者包括細(xì)菌、真菌等病原微生物和昆蟲等節(jié)肢動(dòng)物,后者則代指高鹽、干旱等不利因素,這些環(huán)境脅迫對(duì)作物的生長(zhǎng)和發(fā)育都會(huì)造成嚴(yán)重影響,是導(dǎo)致糧食減產(chǎn)和品質(zhì)降低的主要因素。經(jīng)過長(zhǎng)期的進(jìn)化,植物體產(chǎn)生了一套精細(xì)、復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫,包括絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)級(jí)聯(lián)途徑的激活,脅迫相關(guān)基因的表達(dá),保護(hù)性蛋白的合成等等。篩選并研究植物體中全新的脅迫響應(yīng)基因,深入解析植物響應(yīng)脅迫的分子機(jī)理,對(duì)植物的“抗逆抗病分子育種工作”具有重要意義。非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白(non-specific lipid transfer protein,ns LTPs)是植物中大量存在的一類富含半胱氨酸的小分子堿性脂質(zhì)結(jié)合蛋白,先前研究表明ns LTP能跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)多種脂類物質(zhì),并能夠參與非生物和生物脅迫響應(yīng),但是具體的分子機(jī)理研究較少。我們?cè)谄胀?Nicotiana tabacum,NC89)中克隆并獲得功能未知基因NtLTP4,初步研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)NtLTP4能增強(qiáng)煙草對(duì)干旱、高鹽和青枯菌感染的耐受性。本研究對(duì)NtLTP4參與非生物和生物脅迫的分子機(jī)理進(jìn)行了深入闡析。主要結(jié)果和結(jié)論如下:(1)NtLTP4響應(yīng)多種脅迫誘導(dǎo)表達(dá)模式表明,NtLTP4受多種非生物脅迫(干旱、高鹽和氧化脅迫)、生物脅迫(青枯菌)以及脅迫相關(guān)激素(脫落酸、茉莉酸、水楊酸和乙烯)等的顯著誘導(dǎo)。誘導(dǎo)表達(dá)模式分析表明NtLTP4在植物生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮了重要且復(fù)雜的調(diào)控作用。(2)Nt LTP4是外分泌小蛋白用35S::NtLTP4-GFP轉(zhuǎn)化煙草的亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)化煙草的熒光出現(xiàn)在細(xì)胞邊緣,為確定該蛋白的具體定位,我們?cè)俅无D(zhuǎn)化洋蔥細(xì)胞并進(jìn)行質(zhì)壁分離實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)Nt LTP4主要定位于細(xì)胞壁和細(xì)胞外基質(zhì),說(shuō)明NtLTP4是一種外分泌小蛋白,與其N端存在的分泌信號(hào)肽序列這一結(jié)果相互映證,表明Nt LTP4可能在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮信號(hào)分子的作用。(3)NtLTP4作為正調(diào)控因子參與植物的非生物脅迫響應(yīng)在高鹽和干旱等脅迫條件下,與野生型對(duì)照組相比,NtLTP4的過表達(dá)株系表現(xiàn)出了極強(qiáng)的耐受性,種子萌發(fā)更快,幼苗根長(zhǎng)更長(zhǎng),葉片失水更慢等。通過Na~+探針以及原子吸收法對(duì)Na~+含量進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),過表達(dá)NtLTP4明顯降低了轉(zhuǎn)基因煙草的Na~+含量,說(shuō)明NtLTP4影響了植物體內(nèi)Na~+的穩(wěn)態(tài)。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),鹽脅迫下,NtLTP4過表達(dá)株系中NHX1和HKT1兩個(gè)關(guān)鍵Na~+轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)量明顯高于野生型,說(shuō)明NtLTP4通過調(diào)控NHX1和HKT1促進(jìn)Na~+向液泡的轉(zhuǎn)運(yùn)以及Na~+由地上向地下運(yùn)輸這兩個(gè)過程,減弱了Na~+對(duì)植物細(xì)胞的毒害作用。另外,失水率和氣孔開度的測(cè)定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NtLTP4過表達(dá)煙草葉片氣孔開度小,蒸騰速率低,說(shuō)明NtLTP4能夠通過降低氣孔開度和葉片蒸騰速率來(lái)增強(qiáng)植物對(duì)干旱脅迫的耐受能力。(4)NtLTP4作為正調(diào)控因子參與植物抗病防御反應(yīng)青枯菌病斑檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明,過表達(dá)株系葉片萎蔫程度較低,細(xì)菌含量較少,野生型葉片萎蔫程度較高且細(xì)菌含量較多,說(shuō)明過表達(dá)NtLTP4能夠增強(qiáng)對(duì)青枯菌的抗性。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),過表達(dá)煙草體內(nèi)的病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related protein,PR)的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于野生型;DAB,NBT染色分析以及ROS含量測(cè)定發(fā)現(xiàn),病原菌侵染后轉(zhuǎn)基因煙草具有較低的ROS積累,ROS清除酶的活性和含量遠(yuǎn)高于野生型;進(jìn)一步氣孔開度觀察發(fā)現(xiàn),過表達(dá)NtLTP4能夠促進(jìn)煙草氣孔閉合,減少水分散失,減緩青枯菌侵染引發(fā)的葉片萎蔫。綜上結(jié)果表明,NtLTP4通過誘導(dǎo)PR的表達(dá),增強(qiáng)活性氧的清除,降低氣孔開度,從而增強(qiáng)煙草對(duì)青枯菌的抗性。(5)Nt LTP4位于WIPK信號(hào)下游,并且兩者存在直接互作為了進(jìn)一步分析NtLTP4參與抗病的分子機(jī)理,我們通過酵母雙雜交技術(shù)篩選煙草cDNA文庫(kù),篩選到7個(gè)重要的候選蛋白。有研究表明,MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)通路在植物響應(yīng)非生物和生物脅迫中發(fā)揮著重要的作用,故選擇MAPK家族成員wound-induced protein kinase(WIPK)作為深入研究的對(duì)象。熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(firefly luciferase complementation imaging,LCI),雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(bimolecular fluorescence complementation,BIFC)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(co-Immunoprecipitation,co-IP)進(jìn)一步確定了Nt LTP4與WIPK的互作關(guān)系。為了深入分析NtLTP4與WIPK之間的調(diào)控關(guān)系,我們?cè)趎tltp4突變體中利用TRV下調(diào)WIPK,獲得ntltp4/wipk雙突。接種青枯菌發(fā)現(xiàn),ntltp4/wipk雙突比ntltp4單突和wipk單突對(duì)青枯菌的敏感性加劇,葉片ROS積累增多,氣孔開度更大,表明NtLTP4與WIPK都能參與植物抗病防御過程。進(jìn)一步在NtLTP4過表達(dá)株系中利用TRV下調(diào)WIPK,獲得NtLTP4/wipk材料;接種青枯菌發(fā)現(xiàn),NtLTP4/wipk的表型與NtLTP4過表達(dá)株系的表型相似,葉片青枯菌含量較少,活性氧含量低,氣孔開度減小,對(duì)青枯菌的抗性提高。上述結(jié)果表明,Nt LTP4位于WIPK的下游,與WIPK共同提高植物的抗病性。(6)WIPK可維持NtLTP4的蛋白穩(wěn)定性通過Western Blot對(duì)NtLTP4的蛋白含量檢測(cè)顯示,在wipk突變體中NtLTP4的蛋白含量遠(yuǎn)低于對(duì)照,而在WIPK過表達(dá)株系中,NtLTP4的蛋白含量卻高于對(duì)照,說(shuō)明WIPK能夠促進(jìn)Nt LTP4蛋白的積累。cell-free半體內(nèi)實(shí)驗(yàn)得到相同結(jié)果。而qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),不同實(shí)驗(yàn)材料中NtLTP4的轉(zhuǎn)錄水平是基本一致的,表明WIPK促進(jìn)NtLTP4的蛋白積累并非是調(diào)控NtLTP4的轉(zhuǎn)錄水平實(shí)現(xiàn)的。上述結(jié)果表明,WIPK能夠在蛋白水平維持Nt LTP4的穩(wěn)定性,從而提高植物的抗病性。(7)NPK1-NtMEK2-WIPK-Nt LTP4信號(hào)級(jí)聯(lián)通路參與植物抗病防御過程為建立一條完整的煙草MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)通路,我們利用酵母雙雜交技術(shù)逐一驗(yàn)證了WIPK與煙草中已知的MAP2K/3K成員之間的互作關(guān)系,鑒定出WIPK能與MAPKK成員NtMEK2互作,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)NtMEK2可以與煙草MAPKKK組分NPK1互作,并最終建立了NPK1-NtMEK2-WIPK-NtLTP4信號(hào)級(jí)聯(lián)通路,這一級(jí)聯(lián)通路可能是煙草中重要的抗病信號(hào)通路之一。綜上所述,NtLTP4能夠通過調(diào)控HKT1以及NHX1的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)煙草對(duì)Na~+的清除,減少植物因Na~+積累造成的毒害作用,從而提高鹽脅迫的耐受性,并通過降低蒸騰速率和氣孔開度增強(qiáng)對(duì)干旱脅迫的耐受性。另外,NtLTP4還能夠通過增強(qiáng)活性氧的清除和降低氣孔開度來(lái)提高轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)青枯菌的抗性。更深入地研究表明,Nt LTP4能夠與MAPK級(jí)聯(lián)組分WIPK互作。并且通過NPK1-NtMEK2-WIPK-NtLTP4級(jí)聯(lián)信號(hào)通路穩(wěn)定Nt LTP4蛋白來(lái)參與抗病防御過程,從而增強(qiáng)對(duì)非生物和生物脅迫的耐受性。本研究首次揭示了,煙草中MAPK級(jí)聯(lián)通路與非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白結(jié)合調(diào)控植物響應(yīng)非生物和生物脅迫的分子機(jī)理,具有重要的創(chuàng)新意義。
【圖文】：

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文t al., 2008）。相應(yīng)的，不同的病原分子被不同的受體識(shí)別。目前研究報(bào)道的受體有擬中識(shí)別 flg22 的受體 FLS2（flagellin-sensing 2）（Gomez-Gomez and Boller, 2000）、延伸因子 EF-tu 的受體 EFR（elongation factor receptor）（Zipfel et al., 2006）、擬南識(shí)別幾丁質(zhì)的擬南芥蛋白 CERK（chitin elicitor receptor kinase）和水稻中識(shí)別幾丁水稻蛋白 CEBiP（chitin elicitor-binding protein）（Miya et al., 2007）。

非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白 NtLTP4 作為正調(diào)控因子參與煙草對(duì)非生物和生物脅迫的響應(yīng)（Hetherington and Woodward, 2003）。因此植物體需要控制氣孔的開閉，進(jìn)而作用和水分利用率的動(dòng)態(tài)平衡（Buckley et al., 1999）。氣孔開度的大小也直接合速率、蒸騰速率和水分利用率三者之間的動(dòng)態(tài)平衡。另外，氣孔還是多種病，例如細(xì)菌、真菌、放線菌等進(jìn)入植物體內(nèi)的主要通道（Underwood et al., 200表明，，葉表面的微生物不僅可誘發(fā)氣孔快速閉合，還可引起侵染部位附近 3-2范圍內(nèi)氣孔的群體性關(guān)閉，從而大大降低病菌進(jìn)入宿主的概率（Melotto et al., 2lotto et al., 2008）。病原菌在進(jìn)化過程中會(huì)產(chǎn)生特異的毒性因子使關(guān)閉的氣孔重如丁香假單胞菌番茄致病變種產(chǎn)生的冠菌素（coronatine，COR），真菌產(chǎn)生的以及病原菌 Xcc 分泌的 DSF 細(xì)胞因子（Gudesblat et al., 2009; Guimaraes and S4; Melotto et al., 2006）。因此，在病原菌與植物的持久攻防戰(zhàn)中，氣孔開閉的調(diào)要。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q943.2;S435.72

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本文編號(hào)：2663392