【摘要】：柑橘黃龍病是一種具有百年歷史的柑橘病害,該病害傳播流行快,為害區(qū)域廣,目前尚無(wú)有效的治療方法。黃龍病的病原是韌皮部桿菌屬的三種革蘭氏陰性菌,根據(jù)它們首次被發(fā)現(xiàn)的地點(diǎn)命名為“Candidatus Liberibacter asiaticus”(CLas,亞洲種)、“Candidatus Liberibacter africanus”(CLaf,非洲種)和“Candidatus Liberibacter americanus”(CLam,美洲種)。黃龍病菌可通過(guò)嫁接和三種木虱(Diaphorina citri,Trioza erytreae and Cacopsylla citrisuga)傳播,迄今沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有效分離培養(yǎng)這些細(xì)菌的方法。目前,所有的商業(yè)化柑橘種植品種都是黃龍病敏感寄主。前期通過(guò)生物學(xué)鑒定、PCR檢測(cè)和比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究,表明馬蜂柑對(duì)黃龍病可能具有一定的耐病性。本研究對(duì)感染黃龍病前期(接種CLas 4個(gè)月)和后期(接種CLas 14個(gè)月)的馬蜂柑進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和蛋白組定量分析,從中選取部分差異表達(dá)基因進(jìn)行qPCR驗(yàn)證,以期從基因水平和蛋白水平解析馬蜂柑對(duì)CLas侵染的應(yīng)答機(jī)制。所獲得的主要研究結(jié)果如下:1.為進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度,本研究建立了柑橘黃龍病菌亞洲種微滴式數(shù)字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)檢測(cè)方法,該方法準(zhǔn)確靈敏,可進(jìn)行絕對(duì)定量,其檢測(cè)靈敏度比實(shí)時(shí)熒光定量PCR高100倍。通過(guò)生物學(xué)癥狀和顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn),不論是感病前期還是后期,馬蜂柑幾乎不顯癥,其顯微結(jié)構(gòu)與健康植株相比無(wú)明顯差異,表明馬蜂柑對(duì)黃龍病可能具有潛在的耐病性。2.對(duì)感染前期和后期的馬蜂柑進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,篩選出耐病相關(guān)的差異表達(dá)基因并進(jìn)行了RT-qPCR驗(yàn)證。結(jié)果表明,馬蜂柑感染黃龍病前期共181個(gè)基因差異表達(dá),其中32個(gè)上調(diào),149個(gè)下調(diào),馬蜂柑感染黃龍病后期共1384個(gè)基因差異表達(dá),其中386個(gè)上調(diào),998個(gè)下調(diào)。通過(guò)差異表達(dá)基因表達(dá)趨勢(shì)分析發(fā)現(xiàn),從健康-感病前期-感病后期的過(guò)程中,顯著性富集的趨勢(shì)有2種,分別呈現(xiàn)先下降后上升和先上升后下降的趨勢(shì)。呈趨勢(shì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行KEGG富集分析,發(fā)現(xiàn)呈趨勢(shì)表達(dá)的通路有苯丙素生物合成、單萜類生物合成、淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物-病原菌互作等,表明在CLas脅迫下,馬蜂柑可能通過(guò)調(diào)節(jié)激素代謝水平、合成次生代謝物質(zhì)(如黃酮、木質(zhì)素、酚類化合物等)和抗病相關(guān)蛋白來(lái)制造物理或化學(xué)障礙,以限制CLas的定殖及進(jìn)一步擴(kuò)展。感病前期淀粉合成及降解相關(guān)基因協(xié)同下調(diào)表達(dá),后期編碼胼胝質(zhì)合成酶的基因上調(diào)但倍數(shù)不高,PP2蛋白相關(guān)基因表達(dá)無(wú)明顯差異,表明馬蜂柑在CLas侵染后受影響不大。RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果表明,25個(gè)基因中,22個(gè)基因的驗(yàn)證結(jié)果與RNA-seq測(cè)序結(jié)果的變化趨勢(shì)一致,表明測(cè)序結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。3.對(duì)感染前期和后期的馬蜂柑進(jìn)行了iTRAQ蛋白組定量分析。結(jié)果表明,馬蜂柑感染黃龍病前期共378個(gè)蛋白差異表達(dá),其中232個(gè)上調(diào),146個(gè)下調(diào),馬蜂柑感染黃龍病后期共488個(gè)蛋白差異表達(dá),其中172個(gè)上調(diào),316個(gè)下調(diào)。通過(guò)差異表達(dá)蛋白KEGG Pathway富集分析發(fā)現(xiàn),馬蜂柑感病前期顯著富集的通路有植物-病原菌互作、硫代謝、倍半萜和三萜生物合成、雙萜生物合成等。馬蜂柑感病后期顯著富集的通路有泛素介導(dǎo)的蛋白水解、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、苯丙素生物合成等。馬蜂柑感病前期差異表達(dá)蛋白涉及的代謝途徑及差異蛋白數(shù)量較后期少,且整體呈上調(diào)趨勢(shì),后期呈下降趨勢(shì)。與轉(zhuǎn)錄組相關(guān)聯(lián)的差異蛋白有56個(gè),其中與差異基因表達(dá)趨勢(shì)相同的有45個(gè)。多數(shù)差異蛋白參與了植物的抗逆響應(yīng),如苯丙氨酸解氨酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、神秘果類蛋白、GDSL脂解酶、過(guò)氧化物酶、過(guò)氧羥基脂肪酸羥化環(huán)氧化酶、纖維素合酶、大根香葉烯D合酶、伸展蛋白和植物凝集素等。
【圖文】：

圖 3.1 PCR 擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖M： 2000 bp 分子量 marker； 1-4： 樣品； 5： 負(fù)對(duì)照； 6： 水Fig. 3.1 Agarose gel electrophoresis of PCR productM： 2000 bp DNA marker； 1-4： Samples； 5： Negative control； 6： Water.膠純化后 PCR 產(chǎn)物與 pEASY -T1 載體連接，轉(zhuǎn)化 Trans1-T1 大腸桿菌 PCR 驗(yàn)證結(jié)果顯示，所獲片段大小為 76bp，與目標(biāo)大小一致（圖 3.部分陽(yáng)性克隆送上海英濰捷基公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng) Blast 分析所擴(kuò)帶序列與 CLas 序列同源性為 100%， 表明所擴(kuò)增條帶為目的片段。

圖 3.1 PCR 擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖M： 2000 bp 分子量 marker； 1-4： 樣品； 5： 負(fù)對(duì)照； 6： 水Fig. 3.1 Agarose gel electrophoresis of PCR productM： 2000 bp DNA marker； 1-4： Samples； 5： Negative control； 6： Water.膠純化后 PCR 產(chǎn)物與 pEASY -T1 載體連接，轉(zhuǎn)化 Trans1-T1 大腸桿 PCR 驗(yàn)證結(jié)果顯示，，所獲片段大小為 76bp，與目標(biāo)大小一致（圖 部分陽(yáng)性克隆送上海英濰捷基公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng) Blast 分析所帶序列與 CLas 序列同源性為 100%， 表明所擴(kuò)增條帶為目的片段。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S436.66

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本文編號(hào)：2662456