【摘要】：葡萄是世界重要栽培果樹(shù)之一,歐洲葡萄(Vitis vinifera)品種因優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)而被廣泛栽培,但其突出缺點(diǎn)是抗病害能力弱,尤其是白粉病[Uncinula necator(Schw.)Burr],病害對(duì)葡萄的產(chǎn)量與品質(zhì)造成嚴(yán)重的損失。中國(guó)野生葡萄資源蘊(yùn)藏著豐富的抗病性,中國(guó)野生毛葡萄‘丹鳳-2’不僅白藜蘆醇含量高而且抗病性強(qiáng),是葡萄育種的重要種質(zhì)資源。本研究從‘丹鳳-2’中篩選了果實(shí)中高表達(dá)的芪合成酶基因VqSTS13、VqSTS26和葉片中高表達(dá)的VqSTS32,經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化至歐洲葡萄無(wú)核白中,獲得轉(zhuǎn)基因葡萄植株,對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行接種白粉菌的抗病性鑒定;進(jìn)一步以野生型無(wú)核白和課題組前期獲得的VqSTS6轉(zhuǎn)基因無(wú)核白為試材,通過(guò)抑制劑處理和微嫁接實(shí)驗(yàn),研究白粉菌誘導(dǎo)下芪合成酶的產(chǎn)物芪類植保素的積累特性。取得的主要結(jié)果如下:1.克隆了中國(guó)野生毛葡萄芪合成酶基因VqSTS13(JQ868685)、VqSTS26(JQ868666)和VqSTS32(JQ868672)的cDNA序列,序列大小為1179 bp,經(jīng)與歐洲葡萄基因組Vitis vinifera cv.‘Pinot Noir’clone PN40024序列比對(duì),得出VqSTS13、VqSTS26、VqSTS32均定位于葡萄第16號(hào)染色體上,編碼392個(gè)氨基酸。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明VqSTS13、VqSTS26、VqSTS32定位在細(xì)胞質(zhì)中。2.通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,分別將攜帶‘丹鳳 2’VqSTS13、VqSTS26和VqSTS32基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入歐洲葡萄無(wú)核白中,獲得了VqSTS26、VqSTS32轉(zhuǎn)基因無(wú)核白植株。經(jīng)PCR檢測(cè)和Western blot鑒定,獲得轉(zhuǎn)VqSTS26基因無(wú)核白株系8株、轉(zhuǎn)VqSTS32基因無(wú)核白株系5株。3.對(duì)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行生物與非生物脅迫處理下芪合成酶基因的表達(dá)分析,轉(zhuǎn)基因植株芪合成酶基因的表達(dá)水平提高;分析芪合成酶代謝通路相關(guān)基因表達(dá),芪合成酶上游PAL基因與下游RSGT基因的表達(dá)水平上調(diào),而與芪合成酶存在底物競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的CHS基因表達(dá)下調(diào)。4.通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株人工接種白粉菌鑒定,發(fā)現(xiàn)白粉菌菌絲生長(zhǎng)發(fā)育比野生型無(wú)核白生長(zhǎng)慢;轉(zhuǎn)基因植株的芪合成酶基因表達(dá)水平及其產(chǎn)物芪類物質(zhì)的積累量顯著高于野生型無(wú)核白;轉(zhuǎn)基因植株對(duì)白粉病的抗性增強(qiáng)。5.以實(shí)驗(yàn)室前期創(chuàng)建的VqSTS6轉(zhuǎn)基因無(wú)核白為砧木,通過(guò)微嫁接實(shí)驗(yàn)研究野生型無(wú)核白與嫁接苗對(duì)其白粉菌的抗性。結(jié)果表明:VqSTS6-Flag融合蛋白不發(fā)生根-莖的組織間轉(zhuǎn)運(yùn),而根部過(guò)表達(dá)VqSTS6基因可以促進(jìn)地上部野生型無(wú)核白的芪類物質(zhì)積累,提高對(duì)白粉病的抗性。微嫁接實(shí)驗(yàn)也證明根部過(guò)表達(dá)VqSTS6也可以提高其他不同品種歐洲葡萄的芪類物質(zhì)含量。綜上所述,‘丹鳳-2’芪合成酶基因VqSTS26、VqSTS32轉(zhuǎn)入歐洲葡萄品種無(wú)核白后,不僅提高了無(wú)核白芪合成酶基因的表達(dá)水平,而且促進(jìn)了芪類物質(zhì)的積累,增強(qiáng)了無(wú)核白對(duì)白粉病的抗性;根部過(guò)表達(dá)VqSTS6基因可以促進(jìn)野生型無(wú)核白接穗芪類物質(zhì)的積累并增強(qiáng)其白粉病抗性。因此,中國(guó)野生毛葡萄‘丹鳳-2’及其攜帶的芪合成酶基因,是定向改良?xì)W洲葡萄品種白粉病抗性與增加芪類物質(zhì)含量的重要種質(zhì)資源。
【圖文】：

14 2 ‘丹鳳-2’芪合成酶基因 VqSTS13、VqSTS26、VqSTS32 的序列與聚類分析。A：VqSTSTS26、VqSTS32 的染色體定位分析；B：VqSTS13、VqSTS26、VqSTS32 與歐洲葡萄同源酸序列比對(duì)；陰影部分為差異位點(diǎn)，方框部分為保守序列；C：VqSTS13、VqSTS26、Vq洲葡萄（Vitis vinifera）、高粱（Sorghum bicolor）、花生（Arachis hypogaea）、白松（bus）、樟子松（Pinus sylvestris）和松葉蘭（Psilotum nudum）芪合成酶基因氨基酸序列聚VqSTS13（AFM56662.1）、VqSTS26（AFM56643.1）、VqSTS32（AFM56649.1）、VvP_002268756.1）、VvSTS29（CAA54221.1）、VvSTS48（NP_001267934.1）、SbSTS（AAL49TS（BAA78617）、PstrSTS（CAA87012）、PsylSTS（CAA43165）和 PnSTS（BAA879

the shading is the difference site and the box part is the conserved sequence; C: Cluster analysis of aminoacid sequence of VqSTS13, VqSTS26, VqSTS32 and STS from Vitis vinifera, Sorghum bicolor, Arachishypogaea, pinus strobus, pinus sylvestris and psilotum nudum; VqSTS13 (AFM56662.1), VqSTS26(AFM56643.1), VqSTS32 (AFM56649.1), VvSTS15 (XP_002268756.1), VvSTS29 (CAA54221.1),VvSTS48 (NP_001267934.1), SbSTS (AAL49965), AhSTS (BAA78617), PstrSTS (CAA87012),PsylSTS (CAA43165) and PnSTS (BAA87924).2.3.2 中國(guó)野生毛葡萄‘丹鳳-2’芪合成酶基因 VqSTS13、VqSTS26 和VqSTS32 葡萄白粉菌誘導(dǎo)表達(dá)分析為了研究‘丹鳳-2’芪合成酶基因 VqSTS13、VqSTS26 和 VqSTS32 對(duì)白粉菌誘導(dǎo)的響應(yīng)情況，我們對(duì)‘丹鳳-2’葡萄葉片進(jìn)行白粉菌接種處理，并分析自然條件下及接菌0 hpi、12 hpi、24 hpi、48 hpi、72 hpi、96 hpi和120 hpi葉片中芪合成酶基因VqSTS13、VqSTS26 和 VqSTS32 的表達(dá)情況。結(jié)果表明：VqSTS13、VqSTS26 和 VqSTS32 可以響應(yīng)白粉菌的誘導(dǎo)表達(dá)，基因相對(duì)表達(dá)水平均在接菌 12 hpi 達(dá)最高峰，，恢復(fù)后又于接菌72 hpi 表達(dá)上升，并于接菌 120 hpi 表達(dá)水平達(dá)第二次峰值。其中，VqSTS26 在接菌 12hpi 的上調(diào)水平最高。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S436.631.1

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本文編號(hào)：2660463