【摘要】：銅是生物必需的微量元素,是多種酶的輔因子,如細(xì)胞色素c和銅鋅超氧化物歧化酶等。缺少銅將影響生物的生長,導(dǎo)致生長遲緩甚至死亡。在植物中,銅離子還參與光合作用、電子傳遞和植物激素乙烯的識(shí)別等過程,影響植物多個(gè)生長發(fā)育進(jìn)程。作為一種重金屬離子,銅離子對微生物具有毒性。銅離子能夠抑制孢子的萌發(fā),使細(xì)菌和真菌的酶喪失活性。因此,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,銅制劑被用于防治多種植物病害,以減輕病害導(dǎo)致的損失。近兩百年來,以“波爾多液”為代表的銅基殺菌劑被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn),在防治多種植物病害中發(fā)揮了重要功能。盡管在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多病原微生物對銅具有耐受性,但噴施銅基殺菌劑仍然能夠有效防控病害,這一現(xiàn)象暗示銅離子除了通過重金屬毒性直接殺傷病原微生物外,還可能存在其它病害防控途徑�；谄渌亟饘匐x子如鎘等能激發(fā)植物免疫的事實(shí),我們提出銅離子是一種激發(fā)子的假說,并圍繞銅激活的植物免疫反應(yīng)和分子機(jī)制進(jìn)行了研究。以模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)和丁香假單胞菌番茄致病變種DC3000(Pseudomonas syringae pv tomato DC3000,DC3000)為對象,對銅離子激發(fā)擬南芥的免疫機(jī)制進(jìn)行了探索。獲得如下結(jié)果:(1)發(fā)現(xiàn)噴施低于影響DC3000生理濃度的硫酸銅(100μM或低至10 nM時(shí)),仍然能增強(qiáng)擬南芥對DC3000的抗性。通過比較硫酸銅、氯化銅、硫酸鎂之間的差異,明確銅離子是增強(qiáng)擬南芥抗病性的因素。(2)發(fā)現(xiàn)噴施銅離子可以激活擬南芥一系列的抗性生理反應(yīng),包括絲裂原活化蛋白激酶的快速磷酸化、活性氧類物質(zhì)和胼胝質(zhì)的積累、PR1等多個(gè)病程相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)。通過擬南芥突變體證實(shí)銅離子激發(fā)的抗病性依賴乙烯和水楊酸信號(hào)途徑。(3)對硫酸銅處理2小時(shí)和24小時(shí)的擬南芥進(jìn)行RNA-seq分析,并同已發(fā)表的鞭毛蛋白氨基端保守序列flg22和延伸因子EF-Tu(elf26)觸發(fā)的擬南芥表達(dá)譜進(jìn)行比較分析。發(fā)現(xiàn)銅離子引起的差異表達(dá)基因(DEGs)有517個(gè)與flg22或elf26介導(dǎo)的差異表達(dá)基因相同,其中370個(gè)為共同上調(diào)表達(dá)的基因,暗示銅離子觸發(fā)的植物免疫非常類似PAMP分子觸發(fā)的PTI(PAMP-triggered immunity)。(4)從RNA-seq數(shù)據(jù)中挖掘到多個(gè)乙烯生物合成相關(guān)基因受到銅離子的誘導(dǎo)表達(dá)。包括編碼乙烯合成限速酶基因ACS2、ACS6、ACS7、ACS8、ACS11等;氣相色譜技術(shù)測定乙烯積累量也發(fā)現(xiàn),銅離子處理30分鐘即可顯著地提高擬南芥的乙烯合成速率,且在處理1-2小時(shí)內(nèi)乙烯合成速率達(dá)到峰值;進(jìn)一步利用擬南芥突變體分析表明,acs8單突變體響應(yīng)銅離子2小時(shí)的乙烯積累量明顯降低,銅離子介導(dǎo)的對DC3000的抗性消失;而在acs2-1/acs6-1雙突變體和acs1/2/6/4/5/9/7/11八突變體中無明顯變化,闡明了銅離子激發(fā)的抗病性依賴于ACS8基因。(5)為解析銅離子激活A(yù)CS8基因的轉(zhuǎn)錄機(jī)制,用本生煙瞬時(shí)表達(dá)和擬南芥轉(zhuǎn)基因?qū)CS8基因的啟動(dòng)子進(jìn)行了分析。將ACS8基因編碼區(qū)上游1665 bps序列截短后連接GFP基因,確定編碼區(qū)上游-1155至-901區(qū)域存在銅離子響應(yīng)元件;結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測分析的結(jié)果,推測該區(qū)域中的CUP2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的順式作用元件CuRE(copper response element,序列aagaagaaaaa)可能起主要作用;將CuRE順式作用元件與35S mini基礎(chǔ)啟動(dòng)子融合,驅(qū)動(dòng)GFP基因在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá),證實(shí)該元件可以響應(yīng)銅離子激發(fā)的信號(hào);轉(zhuǎn)基因擬南芥材料實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證明CuRE順式作用元件在ACS8基因響應(yīng)銅離子的上調(diào)表達(dá)中是必需的。(6)為解析擬南芥感知銅離子并傳遞信號(hào)的上游分子機(jī)制,我們對擬南芥細(xì)胞膜上銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)子開展研究。采用RNAi策略分別沉默了擬南芥COPT1、COPT2、COPT3、COPT4、COPT5基因,發(fā)現(xiàn)沉默COPT 1、2、3、5基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥依然能夠響應(yīng)銅離子增強(qiáng)對DC3000的抗性,而在沉默COPT4基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥中,銅離子增強(qiáng)的抗病性明顯減弱,其激發(fā)的防衛(wèi)相關(guān)基因PR1、ERF1的表達(dá)量以及胼胝質(zhì)積累量也減弱。用GUS報(bào)告基因分析了COPT4的組織表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)COPT4主要在擬南芥的根、莖以及葉片的維管束中表達(dá),其具體的功能還有待進(jìn)一步揭示。綜上所述,本研究揭示了銅離子可以激發(fā)擬南芥產(chǎn)生依賴于乙烯和水楊酸、類似PTI的植物抗性,揭示了“銅基”農(nóng)藥在直接抑菌之外的新機(jī)制,為銅制劑的廣譜性和持久性特點(diǎn)做了新的注釋。首次揭示了銅離子通過CuRE順式作用元件誘導(dǎo)ACS8基因的表達(dá),促進(jìn)乙烯快速合成的分子機(jī)制,該結(jié)論對于揭示銅制劑產(chǎn)生的“果樹落葉”以及“幼果藥害”等現(xiàn)象的分子機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)COPT4在銅離子激發(fā)的擬南芥免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要功能,為后續(xù)銅離子感知和傳遞機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文 結(jié)果與分析.1 銅離子提高擬南芥對 DC3000 的抗性.1.1 硫酸銅抑制 DC3000 在擬南芥葉片中的增殖100 μM 硫酸銅噴施處理擬南芥，處理 4 小時(shí)后，注射接種濃度為 106cfu/ mLOD600=0.002）的 DC3000，接種 3 天后，觀察擬南芥發(fā)病情況。硫酸銅處理的擬南無論是黃化程度還是壞死面積都顯著低于對照（圖 1A）；統(tǒng)計(jì)擬南芥葉片中的C3000 細(xì)菌數(shù)量，對發(fā)病程度進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖 1B 所示，0 天時(shí)，兩種處理擬南芥葉片中的細(xì)菌數(shù)量無顯著性差異（P > 0.05）；而接種 3 天后，與對照相比，酸銅處理過的擬南芥葉片中細(xì)菌數(shù)量降低了 95.93%（P < 0.01）（圖 1B）。

圖 2硫酸銅、氯化銅、硫酸鎂和水處理擬南芥的細(xì)菌生長曲線Fig.2 Growth of DC3000 in Arabidopsis leaves treated with CuSO4, CuCl2, MgSO4or H2O低于 100 μM 的硫酸銅不抑制 DC3000 在培養(yǎng)基上的生長離子抑制 DC3000 在擬南芥葉片中的增殖（圖 2），，推測出現(xiàn)這種現(xiàn)象的離子直接和 DC3000 接觸，對 DC3000 產(chǎn)生毒性，抑制 DC3000 繁殖；也激發(fā)了擬南芥的防衛(wèi)反應(yīng)，利用擬南芥體內(nèi)的防衛(wèi)系統(tǒng)抑制病原菌。為作用方式，首先開展銅離子對 DC3000 的抑菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖 3A 所示，離子濃度位于 0-200 μM 的濃度范圍內(nèi)時(shí)，銅離子對 DC3000 的生長沒有銅離子濃度進(jìn)一步增大到 500 μM 時(shí)， DC3000 不能在培養(yǎng)基上增殖（圖固體培養(yǎng)基中，200 μM 硫酸銅對 DC3000 的增殖沒有明顯抑制。此之外，本研究還統(tǒng)計(jì)了 DC3000 在含銅液體培養(yǎng)基中的生長情況，結(jié)μM 硫酸銅培養(yǎng)液中 DC3000 在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光度值和對照相比無顯著
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S432.2

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本文編號(hào)：2658018