lncRNA通過miRNA調控家蠶變態(tài)發(fā)育研究

發(fā)布時間：2020-05-09 01:10

【摘要】：家蠶是一種完全變態(tài)發(fā)育昆蟲,一生經(jīng)歷卵、幼蟲、蛹和成蟲四個階段。家蠶作為鱗翅目的模式昆蟲,在鱗翅目害蟲防治中具有重要作用。家蠶的變態(tài)發(fā)育過程需要多種激素以及非編碼RNA的調控,研究變態(tài)發(fā)育過程的基因表達調控機制對蠶桑產(chǎn)業(yè)和鱗翅目害蟲防治都有十分重要的意義。本課題組在前期家蠶的轉錄組測序中發(fā)現(xiàn)了一個長鏈非編碼RNA TCONS_00017454可以產(chǎn)生miRNA bmo-let-7、bmo-mir-100和bmo-mir-2795。let-7在很多物種中非常保守,對細胞的命運決定具有重要作用。為了研究TCONS_00017454的生物學功能以及它在家蠶發(fā)育過程中的調控機制,我們首先研究了TCONS_00017454、bmo-let-7、bmo-mir-100和bmo-mir-2795在家蠶不同發(fā)育時期的表達譜。其次通過在家蠶個體中注射TCONS_00017454 dsRNA干涉TCONS_00017454的表達,研究TCONS_00017454對家蠶變態(tài)發(fā)育的影響。最后,通過在BmN細胞中施加外源蛻皮激素20 E,研究TCONS_00017454通過let-7 miRNA基因簇調控家蠶變態(tài)發(fā)育的分子機制。主要研究結果如下:1.TCONS_00017454與let-7 miRNA基因簇在家蠶幼蟲期的表達譜。以家蠶幼蟲不同發(fā)育時期的總RNA為研究對象,熒光定量PCR檢測TCONS_00017454與let-7miRNA基因簇的表達譜。結果表明,TCONS_00017454與bmo-let-7和bmo-mir-100的表達趨勢一致,而與bmo-mir-2795之間沒有明確的相關性,說明同一基因簇內(nèi)的miRNA可能具有自己獨立的啟動子。2.TCONS_00017454與let-7 miRNA基因簇在家蠶蛹期及成蟲的表達譜。以家蠶蛹期不同發(fā)育時期的總RNA為研究對象,熒光定量PCR檢測TCONS_00017454與let-7 miRNA基因簇的表達譜。結果表明,TCONS_00017454與bmo-let-7的表達趨勢相一致,而與bmo-mir-2795和bmo-mir-100之間的相關性不強,說明在家蠶不同發(fā)育階段,lncRNA和miRNA之間可能存在不同的互作關系。3.在體內(nèi)干涉TCONS_00017454后,導致家蠶發(fā)育異常。通過在體外合成TCONS_00017454 dsRNA,注射3齡1天家蠶,結果發(fā)現(xiàn),注射TCONS_00017454dsRNA后引起家蠶在不同齡期過渡時不能正常蛻皮、拉稀、體型變小。對干涉效果進行檢測,發(fā)現(xiàn)注射dsRNA后,家蠶體內(nèi)TCONS_00017454的相對表達量下調80%,bmo-let-7、bmo-mir-100、bmo-mir-2795的相對表達量分別下調40%、36%和40%。4.細胞實驗驗證TCONS_00017454和miRNA的互作。用5μM的20 E處理BmN細胞48 h后,提取RNA,熒光定量PCR檢測TCONS_00017454和let-7 miRNA基因簇的表達情況。結果表明TCONS_00017454、bmo-let-7、bmo-mir-100和bmo-mir-2795都被20E誘導上調表達。接著我們對bmo-let-7的靶基因進行了檢測,發(fā)現(xiàn)E74、FTZF1的相對表達量被顯著下調,表明TCONS_00017454可通過miRNA let-7調控其靶標基因E74、FTZF1的表達從而參與家蠶變態(tài)發(fā)育。
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