【摘要】：水稻是世界上重要的糧食作物。由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kühn)引起的水稻紋枯病是極具破壞性的水稻病害之一。目前水稻病害研究大多集中在白葉枯病和稻瘟病上,很少有針對紋枯病的相關(guān)研究。而對水稻紋枯病的抗病機制與調(diào)控機理的研究更是少之又少。當前生產(chǎn)上主要是通過培育種植抗病品種來防治作物病害。但由于水稻對紋枯病的抗性是數(shù)量性狀,所以很難通過常規(guī)育種手段來產(chǎn)生高抗紋枯病品種。紋枯病高抗材料的缺乏限制了其抗性育種。因此研究調(diào)控抗病相關(guān)基因表達的啟動子及其互作轉(zhuǎn)錄因子進行抗病育種是防治水稻紋枯病的有效策略。前期實驗室研究發(fā)現(xiàn),水稻基因Os2H16能夠被紋枯病菌所誘導(dǎo),超量表達Os2H16增強了水稻對紋枯病菌的抗性,抑制表達Os2H16會使水稻對紋枯病菌更加敏感。Os2H16基因啟動子是能夠被紋枯病菌誘導(dǎo)的病原誘導(dǎo)表達型啟動子,并且已經(jīng)鑒定到了該啟動子的主要響應(yīng)區(qū)域為-513 bp至-411 bp以及-411 bp至-309 bp。前期通過煙草瞬時表達系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)一個新的存在于-513 bp至-411 bp區(qū)域的能夠獨立響應(yīng)紋枯病菌的順式元件AATCA。本研究通過將AATCA元件轉(zhuǎn)入水稻中進行表達發(fā)現(xiàn)其可以響應(yīng)紋枯病菌的誘導(dǎo),驗證了前期實驗室在煙草瞬時表達中的結(jié)果。我們通過DNA pull-down技術(shù)篩選得到與AATCA元件互作的蛋白。隨后運用酵母單雜交技術(shù)驗證了AATCA元件與OsbHLH057蛋白的互作。通過對OsbHLH057基因進行分析發(fā)現(xiàn)其編碼一個功能未知的蛋白,具有HLH保守結(jié)構(gòu)域,且定位于細胞核。對OsbHLH057基因的病原誘導(dǎo)表達模式進行分析,發(fā)現(xiàn)其可以受紋枯病菌誘導(dǎo)表達,暗示它可能參與水稻對紋枯病菌的響應(yīng)。然后我們還構(gòu)建了OsbHLH057基因超量與基因編輯表達載體,獲得了水稻超量植株和敲除突變體植株,并且檢測了其下游抗病相關(guān)基因Os2H16的表達,發(fā)現(xiàn)在敲除突變體中該基因表達均有一定程度的下調(diào),表明OsbHLH057基因可能通過影響Os2H16的表達來正調(diào)控水稻對紋枯病的抗性。終上所述,本研究對順式作用元件AATCA及其互作轉(zhuǎn)錄因子OsbHLH057進行研究,為利用調(diào)控抗病基因的表達,來提高水稻紋枯病抗性的研究提供了新的理論基礎(chǔ),對進一步研究水稻對紋枯病的抗性機制以及培育抗性水稻品種具有重要的意義。
【圖文】：

Os2H16也進行研究，通過截短發(fā)現(xiàn)兩個受誘導(dǎo)的核心區(qū)間-513到-411與-411到-309，其中-513到-411中存在一個新的病原誘導(dǎo)元件。該元件位于啟動子區(qū)域-508 bp 至-503 bp，其序列為 AATCA，能夠在煙草中響應(yīng)紋枯病菌的誘導(dǎo)。為了鑒定 AATCA 元件及其互作轉(zhuǎn)錄因子的功能，本課題進行了以下研究：3.1AATCA 元件病原誘導(dǎo)活性的功能驗證之前的啟動子缺失實驗已經(jīng)證實在煙草中AATCA元件能夠響應(yīng)紋枯病菌YWK196的誘導(dǎo)。為了驗證在水稻中 AATCA 元件能否被病原菌誘導(dǎo)，我們構(gòu)建了 AATCA 元件重復(fù)序列的 35S minimal 啟動子表達載體 2×AATCA-35S mini-GFP，并以空載體為對照，分別轉(zhuǎn)入水稻中花 11。獲得轉(zhuǎn)基因植株后，對其接種 YWK196 18 h 后檢測 GFP 表達強度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)有空載體的水稻中，接種與不接種 GFP 信號強度相似，基本檢測不到GFP 熒光的表達，而轉(zhuǎn)有 AATCA 元件的水稻在接種后表現(xiàn)出很強的熒光信號（圖 1A）。進一步利用 GFP 定量分析發(fā)現(xiàn)，其與觀察結(jié)果完全一致（圖 1B）。這一實驗驗證了前期煙草上瞬時表達的結(jié)果，說明 AATCA 元件能夠響應(yīng) YWK196 的誘導(dǎo)。

3.3AATCA 與 OsbHLH057 在本生煙中的共表達分析為了驗證 OsbHLH057 基因能否激活 AATCA 元件的表達，我們克隆了 OsbHLH0的 cDNA 序列，然后將其連入 pCXUN-Myc 載體，并構(gòu)建 POs2H16啟動子全長、POs2H啟動子全長缺失 AATCA 元件和 AATCA 的 GFP 載體（圖 3A）。然后分別將 POs2H16動子全長、POs2H16啟動子全長缺失 AATCA 元件和 AATCA 與 OsbHLH057-pCXUN-M在本生煙葉片中共同瞬時表達，以 pCXUN-Myc 空載體為對照。結(jié)果表明，空載體POs2H16啟動子全長、POs2H16啟動子全長缺失 AATCA 元件和 2×AATCA-35S mini-GFP 同注射的煙草葉片中均檢測不到熒光信號，而同時轉(zhuǎn)有 OsbHLH057 與 POs2H16啟動子長、POs2H16啟動子全長缺失 AATCA 元件和 2×AATCA-35S mini-GFP 的煙草葉片中可檢測到 GFP 的表達，其中全長啟動子缺失 AATCA 元件后熒光信號減弱（圖 3B，3C）說明 OsbHLH057 在植物體內(nèi)可以與 AATCA 元件結(jié)合并激活 AATCA 的表達，，且可以活 POs2H16啟動子不僅僅是依賴 AATCA 元件。
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S435.111.42

【參考文獻】

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本文編號：2650753