【摘要】：棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)屬于鱗翅目、夜蛾科,是重要農(nóng)業(yè)害蟲,危害包括棉花、玉米、辣椒在內(nèi)的200多種農(nóng)作物,每年造成大量的經(jīng)濟(jì)損失。棉鈴蟲產(chǎn)卵量大,單只雌蟲在自然狀態(tài)下平均產(chǎn)卵1426粒,最多達(dá)21738粒。環(huán)境溫度變化可以顯著影響棉鈴蟲的產(chǎn)卵量,其中25℃-30℃最為適宜。卵黃原蛋白(vitellogenin,Vg)的合成是昆蟲產(chǎn)生大量成熟卵的前提基礎(chǔ),也是昆蟲生殖調(diào)控研究的重要科學(xué)問題,包括棉鈴蟲在內(nèi)的許多昆蟲,Vg合成是由保幼激素(juvenile hormone,JH)調(diào)控。Vg在JH作用下在脂肪體內(nèi)大量合成并由血淋巴運(yùn)送到卵巢,最終以卵黃蛋白(vitellin,Vn)的形式儲(chǔ)存于卵母細(xì)胞。但是,對(duì)環(huán)境溫度和JH如何協(xié)同調(diào)控Vg表達(dá)和卵黃發(fā)生的分子機(jī)理缺乏了解。本論文前期研究發(fā)現(xiàn),熱休克因子(Heat shock factor,HSF)參與環(huán)境溫度和JH對(duì)Vg表達(dá)的協(xié)同調(diào)控,但其中的分子機(jī)制有待深入研究。本論文以棉鈴蟲雌性成蟲為實(shí)驗(yàn)材料,取羽化后正常發(fā)育6 h、12 h、24 h、48 h和72 h的脂肪體樣本,Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示HSF和Vg表達(dá)量呈正相關(guān)。體內(nèi)JH類似物(JHA)處理發(fā)現(xiàn),JH可以誘導(dǎo)脂肪體內(nèi)Vg的合成。通過RNAi干擾HSF后,Vg的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平都顯著下降,卵巢發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟受到顯著抑制;另外,HSF RNAi顯著抑制JH誘導(dǎo)Vg的表達(dá),以上結(jié)果表明HSF參與JH信號(hào)通路調(diào)控Vg表達(dá)。構(gòu)建HSF過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染至果蠅細(xì)胞系中,JH誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn),HSF磷酸化水平隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,而且JH通過PKA催化HSF磷酸化;為了進(jìn)一步確定PKA催化HSF磷酸化,PKA抑制劑H89在細(xì)胞誘導(dǎo)前加入細(xì)胞中,結(jié)果發(fā)現(xiàn),H89顯著抑制JH誘導(dǎo)的HSF磷酸化,該結(jié)果表明JH激活PKA催化HSF磷酸化。HSF的亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn),在15℃條件下,HSF主要分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中;27℃條件下HSF向細(xì)胞核內(nèi)運(yùn)動(dòng),并且在一定溫度下經(jīng)過JH誘導(dǎo)后HSF亞細(xì)胞定位沒有變化。對(duì)Vg啟動(dòng)子區(qū)序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),其存在6個(gè)HSF可能的結(jié)合位點(diǎn),結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)ATTCCATTCA可能是HSF的結(jié)合序列。啟動(dòng)子活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),RFP-His表達(dá)量隨著JH濃度梯度的增加和JH時(shí)間梯度的延長(zhǎng)而增加;而且過表達(dá)HSF能顯著增強(qiáng)JH誘導(dǎo)的RFP-His表達(dá),表明HSF能夠增強(qiáng)Vg啟動(dòng)子的活性。本論文首次以HSF為切入點(diǎn),從分子機(jī)制上解析了環(huán)境溫度和JH對(duì)Vg表達(dá)的協(xié)同作用,首次發(fā)現(xiàn)HSF在發(fā)揮基因調(diào)控功能上既響應(yīng)環(huán)境溫度的變化,也響應(yīng)JH滴度的變化。JH通過PKA觸發(fā)HSF磷酸化,適宜的環(huán)境溫度(例如27℃)促進(jìn)HSF入核。HSF結(jié)合Vg基因上游含有ATTCCATTCA的DNA序列上調(diào)Vg的轉(zhuǎn)錄。研究結(jié)果豐富了對(duì)JH和環(huán)境溫度調(diào)節(jié)昆蟲Vg表達(dá)和生殖力的分子機(jī)制的了解。
【圖文】：

圖 3-1 溫度變化對(duì)棉鈴蟲產(chǎn)卵量以及 Vg 和 HSF 表達(dá)量的影響（A）橫坐標(biāo)為五組溫度，15℃、18℃、21℃、24℃、27℃。縱坐標(biāo)為每對(duì)蟲子的平均產(chǎn)卵量著溫度的升高棉鈴蟲的產(chǎn)卵量也隨著增多。（B）橫坐標(biāo)為五組溫度，15℃、18℃、21℃、24℃7℃，縱坐標(biāo)為 Vg 和 HSF 的表達(dá)量。Vg 和 HSF 的表達(dá)量隨著溫度的升高而升高。

圖 3-2 Vg 啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)利用 Gene Regulation 網(wǎng)站在線預(yù)測(cè)了 Vg 啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)。3.3 棉鈴蟲 Vg，Actin 和 HSF 抗體特異性檢測(cè)根據(jù)棉鈴蟲 Vg、Actin 和 HSF ORF 序列，利用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)了含有
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S435.622.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 李建成，郭金霞，趙文臣，李智慧，曹桂云;棉鈴蟲猖獗危害與蟲源基數(shù)及氣象因子關(guān)系分析[J];河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);1996年03期

2 吳坤君,李超,李明輝;棉鈴蟲自然種群生命表及其初步分析[J];昆蟲知識(shí);1979年05期

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本文編號(hào)：2647228