【摘要】：棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)屬于鱗翅目、夜蛾科,是重要農(nóng)業(yè)害蟲,危害包括棉花、玉米、辣椒在內(nèi)的200多種農(nóng)作物,每年造成大量的經(jīng)濟損失。棉鈴蟲產(chǎn)卵量大,單只雌蟲在自然狀態(tài)下平均產(chǎn)卵1426粒,最多達21738粒。環(huán)境溫度變化可以顯著影響棉鈴蟲的產(chǎn)卵量,其中25℃-30℃最為適宜。卵黃原蛋白(vitellogenin,Vg)的合成是昆蟲產(chǎn)生大量成熟卵的前提基礎(chǔ),也是昆蟲生殖調(diào)控研究的重要科學問題,包括棉鈴蟲在內(nèi)的許多昆蟲,Vg合成是由保幼激素(juvenile hormone,JH)調(diào)控。Vg在JH作用下在脂肪體內(nèi)大量合成并由血淋巴運送到卵巢,最終以卵黃蛋白(vitellin,Vn)的形式儲存于卵母細胞。但是,對環(huán)境溫度和JH如何協(xié)同調(diào)控Vg表達和卵黃發(fā)生的分子機理缺乏了解。本論文前期研究發(fā)現(xiàn),熱休克因子(Heat shock factor,HSF)參與環(huán)境溫度和JH對Vg表達的協(xié)同調(diào)控,但其中的分子機制有待深入研究。本論文以棉鈴蟲雌性成蟲為實驗材料,取羽化后正常發(fā)育6 h、12 h、24 h、48 h和72 h的脂肪體樣本,Western blot檢測結(jié)果顯示HSF和Vg表達量呈正相關(guān)。體內(nèi)JH類似物(JHA)處理發(fā)現(xiàn),JH可以誘導脂肪體內(nèi)Vg的合成。通過RNAi干擾HSF后,Vg的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平都顯著下降,卵巢發(fā)育和卵母細胞成熟受到顯著抑制;另外,HSF RNAi顯著抑制JH誘導Vg的表達,以上結(jié)果表明HSF參與JH信號通路調(diào)控Vg表達。構(gòu)建HSF過表達載體并轉(zhuǎn)染至果蠅細胞系中,JH誘導后發(fā)現(xiàn),HSF磷酸化水平隨著誘導時間的延長而增加,而且JH通過PKA催化HSF磷酸化;為了進一步確定PKA催化HSF磷酸化,PKA抑制劑H89在細胞誘導前加入細胞中,結(jié)果發(fā)現(xiàn),H89顯著抑制JH誘導的HSF磷酸化,該結(jié)果表明JH激活PKA催化HSF磷酸化。HSF的亞細胞定位發(fā)現(xiàn),在15℃條件下,HSF主要分布在細胞質(zhì)和細胞核中;27℃條件下HSF向細胞核內(nèi)運動,并且在一定溫度下經(jīng)過JH誘導后HSF亞細胞定位沒有變化。對Vg啟動子區(qū)序列進行分析后發(fā)現(xiàn),其存在6個HSF可能的結(jié)合位點,結(jié)合雙熒光素酶報告實驗,發(fā)現(xiàn)ATTCCATTCA可能是HSF的結(jié)合序列。啟動子活性實驗發(fā)現(xiàn),RFP-His表達量隨著JH濃度梯度的增加和JH時間梯度的延長而增加;而且過表達HSF能顯著增強JH誘導的RFP-His表達,表明HSF能夠增強Vg啟動子的活性。本論文首次以HSF為切入點,從分子機制上解析了環(huán)境溫度和JH對Vg表達的協(xié)同作用,首次發(fā)現(xiàn)HSF在發(fā)揮基因調(diào)控功能上既響應(yīng)環(huán)境溫度的變化,也響應(yīng)JH滴度的變化。JH通過PKA觸發(fā)HSF磷酸化,適宜的環(huán)境溫度(例如27℃)促進HSF入核。HSF結(jié)合Vg基因上游含有ATTCCATTCA的DNA序列上調(diào)Vg的轉(zhuǎn)錄。研究結(jié)果豐富了對JH和環(huán)境溫度調(diào)節(jié)昆蟲Vg表達和生殖力的分子機制的了解。
【圖文】：

圖 3-1 溫度變化對棉鈴蟲產(chǎn)卵量以及 Vg 和 HSF 表達量的影響（A）橫坐標為五組溫度，15℃、18℃、21℃、24℃、27℃。縱坐標為每對蟲子的平均產(chǎn)卵量著溫度的升高棉鈴蟲的產(chǎn)卵量也隨著增多。（B）橫坐標為五組溫度，15℃、18℃、21℃、24℃7℃，縱坐標為 Vg 和 HSF 的表達量。Vg 和 HSF 的表達量隨著溫度的升高而升高。

圖 3-2 Vg 啟動子區(qū)的結(jié)合位點利用 Gene Regulation 網(wǎng)站在線預測了 Vg 啟動子區(qū)的結(jié)合位點。3.3 棉鈴蟲 Vg，Actin 和 HSF 抗體特異性檢測根據(jù)棉鈴蟲 Vg、Actin 和 HSF ORF 序列，利用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計了含有
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S435.622.3

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 李建成，郭金霞，趙文臣，李智慧，曹桂云;棉鈴蟲猖獗危害與蟲源基數(shù)及氣象因子關(guān)系分析[J];河北農(nóng)業(yè)大學學報;1996年03期

2 吳坤君,李超,李明輝;棉鈴蟲自然種群生命表及其初步分析[J];昆蟲知識;1979年05期

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本文編號：2647228