發(fā)布時間：2020-05-01 19:14

【摘要】：籽用南瓜是南瓜屬(Cucurbita)食用種子的栽培種,是黑龍江省的主要經(jīng)濟作物之一。近年來,隨著其種植面積不斷擴大,連作現(xiàn)象多有發(fā)生,導(dǎo)致蔓枯病發(fā)生嚴重,對籽用南瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成嚴重影響。蔓枯病是由蔓枯菌侵染而形成的,蔓枯菌屬于亞隔孢殼屬(Didymella),其發(fā)病快,易大面積傳播、蔓延,常造成瓜類作物產(chǎn)量和品質(zhì)的大幅下降。然而,籽用南瓜蔓枯菌的優(yōu)勢種群和致病基因不明,嚴重影響防治效果。鑒于此,2012年至2016年期間,對黑龍江省籽用南瓜主產(chǎn)區(qū)進行了實地調(diào)研,采集了籽用南瓜蔓枯病病葉,在分離病原菌的基礎(chǔ)上,結(jié)合形態(tài)學與ITS序列,進行了籽用南瓜蔓枯菌的遺傳多樣性分析,利用高通量測序技術(shù)獲得了全基因組信息,分析了侵染寄主前、后的轉(zhuǎn)錄本差異表達,試驗結(jié)果表明:獲得形態(tài)差異明顯的籽用南瓜蔓枯菌30株,利用ITS序列鑒定其均為Stagonosporopsis cucurbitacearum(Sc.),由此推斷Sc.為該地區(qū)主要的籽用南瓜蔓枯菌種群。綜合菌落顏色、形態(tài)、生長速率等方面存在的差異,將籽用南瓜蔓枯菌分為7種形態(tài)學類型,分別命名為Ⅰ型-Ⅶ型。篩選出Sc.最適生長條件:pH值為6.0,生長溫度為25℃,最適碳源為葡萄糖,最適氮源為蛋白胨。通過基因組序列多位點系統(tǒng)進化分析,上述30株菌株可分為兩種基因型(基因型A和B),并分析這些菌株的ITS保守基序,發(fā)現(xiàn)該病原菌具有兩個共有基序(common motifs),不同小種間僅存在共有基序之外的序列差異。保守基序的確定為快速、準確地檢測Sc.,診斷蔓枯病早期癥狀提供數(shù)據(jù)參考。構(gòu)建了Sc.代表菌株zq-1的cDNA文庫,通過PacBio RS II測序,獲得5.24Gb高質(zhì)量基因組數(shù)據(jù),并將原始數(shù)據(jù)過濾和質(zhì)量控制數(shù)據(jù)進行了三代組裝,獲得Sc.的全基因組序列,基因組大小為35.28 Mb,預(yù)測含有9844個基因。其中,基于Rfam數(shù)據(jù)庫識別到82個家族的257個非編碼RNA,1024個含有信號肽的蛋白,2066個跨膜蛋白和756個分泌蛋白;利用CAZyme、TCDB和PHI專有數(shù)據(jù)庫預(yù)測的分泌蛋白數(shù)目分別為605、130、2869個;識別6-mA甲基化位點30833個,4-mC DNA甲基化位點1228069個。獲得的Sc.基因組組裝及注釋信息,為全面深入解析該真菌的基因組信息提供依據(jù)。Sc.與Leptosphaeria maculans(Lm.)菌株在基因組長度(35.28 Mb vs.45.12 Mb)、蛋白編碼基因數(shù)量(9844 vs.12469)等方面都較為相似,推測這兩個菌種存在較近的親緣關(guān)系或在進化階段很接近。通過共線性分析,獲得菌株Sc.和Lm.的相似基因,為進一步揭示Sc.的潛在基因功能、闡明物種進化關(guān)系和探究基因組的內(nèi)部結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)。采用RNA-seq高通量測序技術(shù),開展了Sc.侵染籽用南瓜前、后基因差異表達分析,共獲得44.62Gb的高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)(Q30堿基百分比在92.38%及以上),單個基因進行功能注釋并根據(jù)基因在不同樣品中的表達量,識別差異表達基因341個,其中上調(diào)基因170個,下調(diào)基因171個。對上述差異表達的基因進行GO功能注釋以及KEGG通路分析,預(yù)測52個可能為致病基因,其中34個基因涉及水解酶、蛋白激酶、磷酸酶、纖維素酶等多個分子功能,15個基因涉及生物學進程,3個基因與MAPK通路、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、細胞內(nèi)吞作用相關(guān),這些基因很可能在蔓枯菌的生長和致病過程發(fā)揮重要作用。
【圖文】：

圖 1-1 基于 RNA-seq 技術(shù)的不同研究方向Fig.1-1 Different research directions based on RNA-seq techno是一套從整個 RNA 分子中提取 cDNA 序列，然后構(gòu)建文庫和基因表達具有時間依賴性、細胞依賴性和刺激依賴性，許多位-seq 允許在特定的發(fā)育階段或特定的治療條件下量化每個轉(zhuǎn)錄此外，RNA-seq 允許以一種相當公正的方式分析轉(zhuǎn)錄組，具有態(tài)檢測范圍和低背景信號。與基于雜交的技術(shù)相比，它不僅可詢問，而且還可以應(yīng)用于尚未裝配完整參考基因組的物種。R發(fā)展的過程，包括測序技術(shù)的發(fā)展、實驗設(shè)計和算法開發(fā)。與不斷涌現(xiàn)。存在大量成熟的工具來滿足 RNA-seq 數(shù)據(jù)分析的取映射。年里，RNA-seq 在基因組、表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組的表征和量化一代測序（NGS）技術(shù)擺脫了以往技術(shù)的諸多限制，如陣列技叉雜交背景、信號飽和引起的檢測動態(tài)范圍限制等。此外，這率下產(chǎn)生大而復(fù)雜的數(shù)據(jù)集，而且成本不斷下降，因此它為更基因組提供了可能。RNA-seq 是使用第二代測序方法以確定重復(fù)性高、定量準確、分析可靠、應(yīng)用范圍廣、價格便宜等特

圖 1-2 SMRT 測序技術(shù)的實驗流程及信息分析流程[88]Fig.1-2 Experimental and information analysis procedures of SMRT sequencing technology獲得物種的基因組數(shù)據(jù)之后，通過對基因的詳細解析，，才能形成研究結(jié)果，所以基因的功能預(yù)測是不可或缺的，由此加速了生物信息學的發(fā)展和應(yīng)用，早先這一學科主要用于基因組學和蛋白質(zhì)組學，之后擴展到轉(zhuǎn)錄組學和代謝組學。生物信息學是一門新興的學科，以核酸和蛋白質(zhì)序列為基礎(chǔ)，通過序列信息的比對，來預(yù)測未知基因并分析基因結(jié)構(gòu)和功能。構(gòu)建數(shù)據(jù)庫是生物信息學分析的重要環(huán)節(jié)，根據(jù)具體的分析目的來構(gòu)建相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，一般情況使用公共數(shù)據(jù)庫平臺就可以進行分析，包括：美國國家生物技術(shù)信息中心 NCBI（ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ） 、 日 本 信 息 生 物 學 中 心 DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/ ）和歐洲核酸序列數(shù)據(jù)庫 EMBL（http://www.ebi.ac.uk/），這三大平臺信息全、范圍廣、更新快，受到眾多科研人員的青睞。隨著基因組學研究的不斷深入，加快了生物信息學的發(fā)展，各種功能因子相關(guān)的數(shù)據(jù)庫和生物軟件的開發(fā)，這又促進了植物病原真菌基因組的解析。目前，病原菌基因組生物信息學分析常用的工具有：Pfam（蛋白質(zhì)家族）數(shù)據(jù)庫、PHI（病原體宿主交互）數(shù)據(jù)庫、CAZy（碳水化合物相關(guān)酶）數(shù)據(jù)庫、TCDB（轉(zhuǎn)運蛋白）數(shù)據(jù)庫、Kin Base（蛋白激酶）數(shù)據(jù)庫、MEROPS（肽酶）數(shù)據(jù)庫、Conserved Domains（保守結(jié)構(gòu)在線）分析平臺、G-protein- coupled receptor（G-蛋白偶聯(lián)受體）數(shù)據(jù)庫等。
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S436.429

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本文編號：2646969