【摘要】：水稻是世界范圍內(nèi)的糧食作物,而病原菌的侵害是水稻種植過程中的主要制約因素。水稻細菌性條斑病(bacterial leaf streak,BLS)簡稱條斑病是由稻黃單胞菌稻生致病變種(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)引起的細菌性病害,該病害逐漸成為非洲西部、中國南方和中部的主要病害。目前尚無攜帶條斑病主效抗病基因的水稻栽培品種,因而探究條斑病菌中的致病因子與水稻之間的互作,對于挖掘潛在的抗病基因以培育抗病品種具有重要的指導意義。本研究從湖北省黃岡市水稻種植區(qū)分離得到一個Xoc小種并命名為HGA4,為了驗證該小種的致病性,以Xoc模式小種RS105作為對照,通過在8個粳稻品種和6個秈稻品種水稻上進行致病力鑒定,結(jié)果顯示HGA4的致病力比RS105更強。為了進一步闡述HGA4的強致病力機制,本研究利用三代測序技術(shù)對HGA4的基因組進行測序以尋找可能的致病因子。轉(zhuǎn)錄激活類效應因子(transcription activator-like effectors,TALEs)是Xoc的主要致病因子,因而本研究根據(jù)HGA4基因組測序數(shù)據(jù)分析了HGA4基因組中所有的TALEs,發(fā)現(xiàn)HGA4中包含28個TALEs,這28個TALEs當中的24個在已經(jīng)測序分析的RS105基因組中均有相應的同源物;而且RS105中僅有24個TALEs,而HGA4基因組中另外的四個TALEs分別為Tal2b、Tal2c、Tal2d和Tal2e。同源性分析顯示,HGA4中的Tal2b與國外Xoc模式小種BLS256中的Tal2c同源,而前人研究顯示BLS256中的Tal2c可能靶定水稻中編碼2-酮戊二酸和亞鐵離子依賴型氧化酶(2-oxoglutarate and Fe(II)-dependent dioxygenase,2OGD)的基因OsF3H03g。進一步的接種誘導表達分析顯示,接種RS105過程中OsF3H03g基因的表達量沒有顯著變化,而接種HGA4過程中OsF3H03g基因被顯著誘導表達。為了驗證Tal2b是否直接靶定OsF3H03g基因,本研究從HGA4基因組中克隆到Tal2b基因,并利用煙草瞬時表達以及凝膠遷移率實驗(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)證明了Tal2b直接結(jié)合OsF3H03g基因啟動子并促進基因表達。同時,將HGA4中的Tal2b轉(zhuǎn)入RS105后發(fā)現(xiàn),RS105/Tal2b可以顯著誘導OsF3H03g基因的表達,而且RS105/Tal2b在水稻葉片上造成的病斑長度顯著長于RS105,說明Tal2b作為Xoc中的毒性因子促進在水稻中的侵染。為了驗證OsF3H03g基因在水稻與Xoc互作中的作用,本研究在中花11(ZH11)水稻中進行遺傳轉(zhuǎn)化獲得OsF3H03g超量表達和抑制表達轉(zhuǎn)基因水稻以及基因編輯水稻。進一步的抗性鑒定顯示,OsF3H03g超量表達轉(zhuǎn)基因水稻對條斑病更加敏感,而抑制表達轉(zhuǎn)基因水稻和基因編輯水稻則提高對條斑病的抗性,說明OsF3H03g負調(diào)控水稻對條斑病的抗性。為了解析OsF3H03g如何參與水稻和Xoc的互作,通過酵母雙雜交篩選到與OsF3H03g發(fā)生互作的一個編碼尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(uridine diphosphate-glycosyltransferase,UGT)的蛋白OsUGT。進一步利用蛋白下拉實驗(Pull-down assay)和雙分子熒光互補(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)實驗驗證了OsF3H03g與OsUGT互作的真實性。同時,在ZH11水稻中對OsUGT基因進行超量表達和抑制表達以及基因編輯修飾操作,結(jié)果顯示超量表達OsUGT基因增加水稻對條斑病的感病性而抑制表達和基因編輯則提高水稻對條斑病的抗性,說明OsUGT同樣作為負調(diào)控因子參與水稻對條斑病的抗性。此外,在OsF3H03g和OsUGT抑制表達轉(zhuǎn)基因株系中,水楊酸(salicylic acid,SA)信號路徑基因被激活,暗示OsF3H03g和OsUGT作用的信號路徑與SA相關(guān)。另一方面,本研究發(fā)現(xiàn)HGA4中的Tal2c與BLS256中的Tal2d同源,而研究顯示BLS256中的Tal2d可能靶定水稻中另外一個編碼2OGD的基因OsF3H04g。接種表達模式分析顯示,RS105不能誘導OsF3H04g基因的表達而HGA4則可以顯著誘導該基因的表達。為了驗證OsF3H04g基因是否參與調(diào)控水稻與Xoc的互作,通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得OsF3H04g超量表達轉(zhuǎn)基因水稻并從韓國水稻突變體庫獲得插入突變體水稻osf3h04g�？剐澡b定結(jié)果顯示,OsF3H04g超量表達轉(zhuǎn)基因水稻對條斑病的感病性增加,但是,OsF3H04g插入失活突變體水稻osf3h04g也表現(xiàn)對條斑病的感病性增加,暗示著該基因在調(diào)控水稻和Xoc互作過程中的功能具有特殊性。為了揭示osf3h04g水稻的感病性機制,對其進行轉(zhuǎn)錄組學分析發(fā)現(xiàn),osf3h04g中的抗病相關(guān)基因以及SA和茉莉酸(jasmonic acid,JA)信號相關(guān)基因下調(diào)表達。進一步的激素測定顯示,osf3h04g中JA含量降低而且與JA合成相關(guān)的基因OsLOX9和OsAOS2在osf3h04g中下調(diào)表達;另外,osf3h04g中SA大幅降低但與SA合成相關(guān)的基因OsPAL和OsICS并沒有顯著變化。有趣的是,在osf3h04g轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中一個同樣編碼2OGD的基因OsS3H呈現(xiàn)大幅的上調(diào)表達。進一步在水稻中對OsS3H基因進行超量表達和基因編輯修飾突變并得到相應的轉(zhuǎn)基因植株,結(jié)果顯示,超量表達OsS3H促使水稻對條斑病的感病性增加而基因編輯修飾則增強水稻對條斑病的抗病性。以上結(jié)果暗示著OsF3H04g基因突變后導致OsS3H基因的表達量提高從而促使感病。綜上所述,本研究揭示了2OGD基因OsF3H03g和OsF3H04g調(diào)控水稻對條斑病的感病機制,這項研究將有利于培育抗條斑病水稻品種。
【圖文】：

如圖1 所示病原菌通過 T3SS 將自身的效應因子（type III secretion system effector, T3SE）注入寄主植物中干擾抗病反應以促進侵染定殖（Buttern and He, 2009）。三型分泌系統(tǒng)分泌的效應因子分為轉(zhuǎn)錄激活類效應因子（transcription activator-like effector, TALE）和非轉(zhuǎn)錄激活類效應因子（Non-TALE），TALEs 可以作為轉(zhuǎn)錄因子進入寄主細胞核啟動宿主基因的表達，而 Non-TALEs 一般通過酶活作用干擾寄主細胞的生物學過程（White et al., 2009）。圖 1 三型分泌系統(tǒng)作用模式 (Buttner and He, 2009)Fig. 1 The type III secretion system work model (Buttner and He, 2009)1.1.2.1 稻黃單胞菌三型分泌系統(tǒng)水稻和黃單胞菌之間的互作作為寄主與病原物互作模式受到廣泛的關(guān)注(Ni o-Liuet al., 2006)，大量的稻黃單胞菌 T3SEs 與寄主水稻的相互作用被鑒定。稻黃單胞菌中的三型分泌系統(tǒng)由 Hrp 基因簇編碼，在 Xoc 小種 RS105 基因組中包含有 10 個 Hrp 基因、9 個 Hrc 基因、8 個 Hpa 基因，其中 HrpF 基因突變會影響 RS105 在煙草上激發(fā)的細胞超敏反應（hypersentivite response, HR）以及在成株期水稻上的致病力（Zou et al.,2006）；而 Hpa2 和 HrpF 相互作用參與調(diào)控 RS105 中的 TALEs 向水稻?

圖 2 TALEs特異性靶定 DNA 模型 (Boch et al., 2009)Fig. 2 Model for special DNA-targets of TALEs (Boch et al., 2009)在數(shù)量眾多的 TALEs，Xoc 中包含有 19-27 個 TA異(Wilkins et al., 2015)；而 Xoo 中同樣包含數(shù)量可種存在較大差異，在亞洲變種中有 15-26 個 TALE北美變種不包含任何 TALEs (Gonzalez et al., 2007, 2016；Erkes et al., 2017) 。目前，Xoc 中鑒定的 T（Cernadas et al., 2014；Read et al., 2016；Hummel Xoo 中已經(jīng)鑒定的 TALEs 包括 AvrXa5、AvrX、PthXo1、PthXo2、PthXo3、PthXo6 和 PthXo7(Zo；Gu et al., 2005；Wang et al., 2014a；Yang et al., 2
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S435.111.4

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