【摘要】：黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia Bouche)是南瓜屬一年或多年生瓜類(lèi)作物,對(duì)瓜類(lèi)枯萎病有較強(qiáng)抗性,已作為嫁接砧木有效控制了瓜類(lèi)枯萎病的發(fā)生和危害。中國(guó)是全球瓜類(lèi)生產(chǎn)大國(guó),枯萎病是影響瓜類(lèi)產(chǎn)量和品質(zhì)的重要病害之一,為鐮孢屬尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)寄生引起的一種真菌土傳病害,在世界范圍內(nèi)的瓜類(lèi)種植區(qū)普遍發(fā)生,一般使瓜類(lèi)減產(chǎn)20%~60%,而培育抗病品種是防控該病最經(jīng)濟(jì)、最有效和環(huán)境友好的途徑。有關(guān)瓜類(lèi)對(duì)枯萎病菌侵染的免疫應(yīng)答機(jī)制及瓜類(lèi)-枯萎病菌互作的分子機(jī)制至今未完全闡明。利用高通量的測(cè)序技術(shù),從轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)水平上研究黑籽南瓜應(yīng)答枯萎病菌侵染的分子機(jī)制。一方面,可以較系統(tǒng)分析抗性基因和抗性蛋白的差異表達(dá)特性,有助于從整體水平上揭示黑籽南瓜應(yīng)答枯萎病菌侵染的代謝通路、信號(hào)傳導(dǎo)和分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò),深入解析黑籽南瓜-枯萎病菌互作的分子機(jī)制,為闡明瓜類(lèi)寄主響應(yīng)枯萎病菌脅迫的抗性機(jī)制提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)信息。另一方面,可獲得差異基因和差異蛋白表達(dá)譜的全景圖,有利于篩選和鑒定起關(guān)鍵作用的抗病基因,為瓜類(lèi)抗枯萎病基因工程育種提供可利用的基因資源。基于此,本研究從黑籽南瓜基因組中克隆NBS類(lèi)抗病基因同源序列(RGAs),并分析不同抗性品種中NBS同源片段的表達(dá)差異,結(jié)合枯萎病癥狀的表現(xiàn)確定抗性基因表達(dá)豐度較高的取樣時(shí)間。在此基礎(chǔ)上,選取抗病材料,利用高通量RNA-Seq技術(shù)和iTRAQ技術(shù),通過(guò)多點(diǎn)時(shí)序比較,構(gòu)建黑籽南瓜應(yīng)答枯萎病菌脅迫的差異基因和差異蛋白表達(dá)譜,分析黑籽南瓜應(yīng)答枯萎病菌侵染的代謝通路和分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò);鎖定和鑒別黑籽南瓜NBS類(lèi)關(guān)鍵抗病基因,構(gòu)建NBS類(lèi)基因的VIGS沉默載體進(jìn)行基因功能的初步驗(yàn)證。獲得的主要研究結(jié)果如下:1.設(shè)計(jì)NBS類(lèi)抗病基因保守結(jié)構(gòu)域的簡(jiǎn)并引物,從黑籽南瓜基因組中分離了8條RGAs,其中HQRGA2(GenBank ID:MG946756)包含NBS類(lèi)抗病基因的4個(gè)保守模塊:P-loop、Kinase-2、Kinase-3a和GLPL區(qū),且具有NB-ARC(nucleotide-binding adaptor shared by APAF-1,R proteins and CED-4)結(jié)構(gòu),為CC-NBS-LRR類(lèi)抗病基因序列。HQRGA2與部分抗病基因序列的核苷酸相似性達(dá)到87%~99%,與中國(guó)南瓜抗病蛋白基因SQRGA-13的氨基酸同源性較高,達(dá)到96.6%,與其余抗病基因同源性在16.6%~43.8%之間。Q-PCR分析顯示3個(gè)黑籽南瓜品種中HQRGA2的表達(dá)均受枯萎病菌脅迫(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)的誘導(dǎo),其中感病白皮品種呈多個(gè)升-降的表達(dá)趨勢(shì),中抗花皮品種呈多個(gè)降-升的趨勢(shì),抗病綠皮品種HQRGA2的表達(dá)水平增加迅速且持續(xù)能力強(qiáng),呈增加-降低的表達(dá)特點(diǎn)。結(jié)合接種后枯萎病出現(xiàn)和發(fā)展特征,確定轉(zhuǎn)錄組和蛋白組測(cè)序取樣時(shí)間為接種枯萎病菌后48h(無(wú)肉眼可見(jiàn)癥狀的潛伏期)和96h(病癥擴(kuò)展期)。2.以抗病綠皮品種為材料,采用傷根法加灌根法接種枯萎病菌,對(duì)接種后48h、96h和對(duì)照(傷根加無(wú)菌水灌根后48h)的黑籽南瓜葉片進(jìn)行RNA-Seq高通量測(cè)序,用Trinity軟件對(duì)Clean reads進(jìn)行組裝,組裝獲得的Unigene在NR、SWISSPROT、KOG、GO、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)得到注釋結(jié)果,FPKM法計(jì)算Unigene表達(dá)量篩選差異表達(dá)基因并進(jìn)行GO功能和Pathway富集分析,研究黑籽南瓜響應(yīng)枯萎病病原菌侵染過(guò)程中同一時(shí)間點(diǎn)及不同時(shí)間點(diǎn)的差異基因表達(dá)變化,構(gòu)建了黑籽南瓜應(yīng)答枯萎病菌侵染的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜。主要結(jié)果如下:(1)黑籽南瓜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序經(jīng)組裝后共獲得62,169條Unigene,N50為1,640bp,最長(zhǎng)Unigene為15,877bp,最短Unigene為301bp,平均長(zhǎng)度為1,160bp。將Unigene和NR、SWISSPROT、KOG、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),共獲得47,521條Unigene(76.44%)的生物信息學(xué)注釋結(jié)果,其中11,676條Unigene(29.40%)能與甜瓜基因組比對(duì)上,11,674條Unigene(29.39%)能與黃瓜基因組比對(duì)上。另有14,648條Unigene(23.56%)未被注釋到,推測(cè)該部分序列可能是新轉(zhuǎn)錄本,或者是黑籽南瓜區(qū)別于其他瓜類(lèi)作物的特有基因。本研究構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)可為研究其他瓜類(lèi)抗病機(jī)制的基因注釋提供參考。(2)通過(guò)接種后不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)量和差異表達(dá)基因分析,對(duì)差異基因進(jìn)行功能注釋和代謝通路富集,Q-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果較為可靠。結(jié)果顯示:(1)受枯萎病菌侵染后,不同時(shí)間點(diǎn)被誘導(dǎo)的大多數(shù)Unigene的功能都是常見(jiàn)的,幾乎涵蓋了植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)方面。共有25,020條Unigene被富集到25個(gè)分子功能家族,其中4,437條Unigene被富集到僅一般功能預(yù)測(cè)(General function prediction only),是富集基因數(shù)最多的一類(lèi),其次2,744條Unigene富集到翻譯后修飾(Posttranslational modification)、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)(Protein turnover)和分子伴侶(Chaperones),2,368條Unigene富集到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(Signal transduction mechanisms),而富集到次生代謝物的合成、運(yùn)輸及分解(Secondary metabolites biosynthesis,Transport and catabolism)與防御機(jī)制(Defense mechanisms)上的基因數(shù)分別是837條和228條。(2)枯萎病菌激活的黑籽南瓜差異表達(dá)基因隨侵染時(shí)間的延長(zhǎng)而增多。接種后48h和96h的差異表達(dá)基因分別為939和2,021個(gè),且下調(diào)基因的數(shù)量大于上調(diào)基因,其中有大量轉(zhuǎn)錄因子和抗病R基因發(fā)生了上調(diào)或下調(diào)表達(dá)。并集分析顯示有721個(gè)差異表達(dá)基因在2個(gè)時(shí)間點(diǎn)中共同差異表達(dá),355個(gè)基因上調(diào)表達(dá),366個(gè)基因下調(diào)表達(dá);具有相同的表達(dá)趨勢(shì)的有444個(gè),238個(gè)持續(xù)上調(diào)表達(dá),206個(gè)持續(xù)下調(diào)表達(dá)。(3)Pathway富集分析顯示,接種后48h時(shí)差異表達(dá)基因參與了細(xì)胞程序性死亡(Necroptosis)、過(guò)氧化物酶體(Peroxisome)、硫胺素代謝(Thiamine metabolism)、淀粉和糖代謝(Starch and sucrose metabolism)、細(xì)胞凋亡(Apoptosis)、糖酵解/糖異生(Glycolysis/gluconeogenesis)、溶菌酶(Lysosome)、細(xì)胞色素P450代謝(Cytochrome P450 metabolism)、丙酮酸鹽代謝(Pyruvate metabolism)、谷胱甘肽代謝(Glutathione metabolism)、抗壞血酸和醛酸鹽代謝(Ascorbate and aldarate metabolism)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Plant hormone signal transduction)等抗病相關(guān)代謝途徑。接種后96h,除上述代謝途徑外,還激活了P53信號(hào)、VEGF信號(hào)和TNF信號(hào)等抗病相關(guān)信號(hào)途徑,枯萎病菌激發(fā)了黑籽南瓜體內(nèi)多種抗病途徑、差異表達(dá)基因涉及防御反應(yīng)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等,顯示黑籽南瓜應(yīng)答枯萎病菌侵染的分子機(jī)制受到多基因網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的調(diào)控。3.在轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的基礎(chǔ)上,以相同處理的材料,利用iTRAQ技術(shù)研究黑籽南瓜應(yīng)答枯萎病菌侵染的差異蛋白表達(dá)譜。結(jié)果表明:(1)總共鑒定到的可信蛋白數(shù)量為1,907個(gè),差異表達(dá)蛋白總數(shù)為567個(gè),CK-VS-48h處理組的差異表達(dá)蛋白有113個(gè),其中60個(gè)差異蛋白通過(guò)KEGG富集到55個(gè)代謝通路;CK-VS-96h處理組有329個(gè),198個(gè)富集在82條通路;48h-VS-96h有125個(gè)。發(fā)現(xiàn)在差異表達(dá)蛋白中有4個(gè)未知功能蛋白,其中的1個(gè)上調(diào)蛋白CL11145contig1是gpi錨定的非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白,對(duì)于抵抗非生物脅迫具有重要作用。另一個(gè)上調(diào)蛋白CL9717contig1為未知蛋白。2個(gè)下調(diào)的未知蛋白CL29643contig1和CL4168contig1均為假定的Csa蛋白,功能有待研究。(2)對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行并集分析找到3個(gè)處理組中有13個(gè)共性差異蛋白,其中與抗性相關(guān)的是S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAM1和SAM2),推測(cè)SAM合成相關(guān)基因也在抗病過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。差異基因和差異蛋白與KEGG通路之間的互作分析表明,接種后48h的基因和蛋白間的相互作用差異比96h大,上調(diào)表達(dá)的互作基因和蛋白數(shù)量比96h多。(3)差異表達(dá)基因與差異表達(dá)蛋白關(guān)聯(lián)性分析表明,接種后48h和96h與轉(zhuǎn)錄組差異基因關(guān)聯(lián)表達(dá)的差異蛋白分別有11個(gè)和39個(gè);KEGG富集分析表明差異基因、差異蛋白和相關(guān)調(diào)節(jié)基因富集到20個(gè)代謝途徑,主要參與了核糖體、苯丙素類(lèi)生物合成、光合生物的碳固定、過(guò)氧化物酶體、乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝和糖酵解/糖異生、半乳糖代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝以及植物激素信號(hào)傳導(dǎo)等途徑。研究結(jié)果為確定需深入研究的代謝通路及鑒定關(guān)鍵抗性蛋白提供依據(jù)。4.綜合黑籽南瓜接種枯萎病菌后的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學(xué)中的pathway富集分析數(shù)據(jù),提出了黑籽南瓜應(yīng)答枯萎病菌侵染的抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò),初步明確了黑籽南瓜應(yīng)答枯萎病菌侵染的分子調(diào)控和信號(hào)傳導(dǎo)途徑,為黑籽南瓜抗病基因的進(jìn)一步挖掘奠定了基礎(chǔ)。(1)受枯萎病菌侵染后,黑籽南瓜通過(guò)膜錨定的枯萎病菌受體蛋白識(shí)別真菌誘導(dǎo)子/PAMPs(病原體相關(guān)分子模式),誘導(dǎo)下游信號(hào)傳導(dǎo)。(2)鈣通道的激活和胞質(zhì)鈣的增加觸發(fā)NADPH氧化酶的激活,導(dǎo)致H_2O_2的產(chǎn)生和活性氧(ROS)爆發(fā)。(3)黑籽南瓜去除根尖后,枯萎病菌快速入侵,病菌的效應(yīng)因子/無(wú)毒基因(AVR)使黑籽南瓜相關(guān)基因作出誤判,從而導(dǎo)致木質(zhì)素合成降低、細(xì)胞間隙擴(kuò)大、細(xì)胞壁降解、光合速率下降、蠟質(zhì)合成下降等過(guò)程,植株的物理抗性并未發(fā)揮作用。(4)隨著病原菌的增多,黑籽南瓜通過(guò)特定的病原體受體(PRRS)和NBS類(lèi)抗病蛋白識(shí)別病菌效應(yīng)因子,從而激活MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。(5)ABA途徑在MYB和NAC等轉(zhuǎn)錄因子的參與下,通過(guò)提高丙酮酸鹽、介導(dǎo)氣孔關(guān)閉、減少蒸騰作用及細(xì)胞程序性死亡來(lái)防御病菌。(6)茉莉酸(JA)途徑主要是通過(guò)茉莉酸甲酯的增加來(lái)促進(jìn)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子或基因的表達(dá),但其中的基因有上調(diào)或下調(diào),預(yù)測(cè)細(xì)胞色素P450和細(xì)胞程序性死亡參與了后期的防御;(7)水楊酸(SA)途徑作為主要的抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,通過(guò)WRKY和BZIP轉(zhuǎn)錄因子激發(fā)了PR1蛋白的表達(dá),從而開(kāi)啟系統(tǒng)性防御過(guò)程(SAR),調(diào)動(dòng)硫胺素、溶菌酶、細(xì)胞程序性死亡,細(xì)胞凋亡、吞噬體等過(guò)程來(lái)清除病菌;(8)產(chǎn)生的ROS通過(guò)抗壞血酸-谷胱苷肽循環(huán)(ASA-GSH)循環(huán)來(lái)清除。(9)過(guò)氧化物酶體在抗病過(guò)程中通過(guò)CAT來(lái)調(diào)節(jié)和平衡ROS的產(chǎn)生。5.針對(duì)NBS-LRR類(lèi)基因在黑籽南瓜抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要作用,本研究采用二代轉(zhuǎn)錄組Unigene和全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組Unigene結(jié)合方法對(duì)NBS類(lèi)基因進(jìn)行了鑒別和篩選。(1)以NB-ARC作為參考氨基酸序列,從黑籽南瓜CDS中鑒定了43條CfNBS(NBS-type gene from C.ficifolia)類(lèi)基因序列,分屬于TNL、CNL、TN、RPW8-N和N類(lèi)六個(gè)亞基因家族,典型的TNL和CNL類(lèi)分別有2個(gè)和13個(gè)。進(jìn)化樹(shù)分析表明,CfNBS類(lèi)基因可以分為4大類(lèi)群,黑籽南瓜的NBS類(lèi)抗病基因數(shù)量較少但其基因分化比其它瓜類(lèi)物種豐富。(2)與二代轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比對(duì),篩選獲得11個(gè)差異表達(dá)的CfNBS類(lèi)關(guān)鍵基因,顯著富集在防衛(wèi)反應(yīng)、谷胱苷肽轉(zhuǎn)運(yùn)、受體絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)合等生物學(xué)過(guò)程和分子功能,富集通路最多的是與TMV抗性蛋白同源的2個(gè)基因(CL19588contig1和CL21402contig1),表明這2個(gè)基因在抗病過(guò)程中起到了重要的作用。接種枯萎病菌后的Q-PCR驗(yàn)證表明,有10個(gè)基因表達(dá)趨勢(shì)同轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)變化趨勢(shì)基本一致。組織表達(dá)特異性分析表明,在根、莖和果皮中表達(dá)量最高的基因分別是CL34065Contig1、CL52011Contig1和CL19588Contig1。6.從黑籽南瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了HQRGA2片段的全長(zhǎng)基因,其Unigene編碼為CL7398Contig1,經(jīng)實(shí)體克隆測(cè)序該基因全長(zhǎng)4,303bp,命名為CfRFN2(Gene Bank ID:MK618462),ORFfinder分析發(fā)現(xiàn)其有一個(gè)完整的編碼框,長(zhǎng)度4,092bp,編碼1,363個(gè)氨基酸。(1)CfRFN2注釋為擬南芥抗病蛋白At4g27190類(lèi)轉(zhuǎn)錄突變體X1同源基因。CfRFN2與其他瓜類(lèi)抗病基因核苷相似性在87%~98%之間,保守結(jié)構(gòu)域分析該基因含有1個(gè)NB-ARC和2個(gè)LRR結(jié)構(gòu)域;推導(dǎo)該基因的信號(hào)肽序列在19~20個(gè)氨基酸之間且不屬于分泌蛋白;CfRFN2蛋白與美洲南瓜和中國(guó)南瓜的RPS2蛋白同源性親緣關(guān)系最近。(2)從克隆載體pEASY-CfRFN2片段3中擴(kuò)增415bp的CfRFN2基因片段,連接入VIGS載體pTRV2,構(gòu)建完成VIGS沉默載體pTRV2-CfRFN2。以含有沉默載體和共轉(zhuǎn)化載體pTRV1的農(nóng)桿菌同時(shí)侵染黑籽南瓜幼苗,28d后以共侵染的植株接種枯萎病菌為處理,以野生型植株接種枯萎病菌為對(duì)照,接種7d后,處理植株較對(duì)照發(fā)病嚴(yán)重,Q-PCR分析顯示處理植株中CfRFN2的相對(duì)表達(dá)量在接種后48h和96h比對(duì)照分別減低34.75%和98.27%,初步表明黑籽南瓜CfRFN2基因具有抗枯萎病的功能。
【圖文】：

分析到的數(shù)據(jù)經(jīng)內(nèi)參基因均雨一化處理后，用2- Ct法達(dá)量， Ct = Ct目的片段－Ct內(nèi)參基因， Ct = Ct處理組平均SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t測(cè)驗(yàn)，檢驗(yàn)差異16作圖。As 的克隆南瓜 DNA 為模板，利用所設(shè)計(jì)的引物(表 3-1)進(jìn)F7 和 HZBB7 擴(kuò)增到約 500 bp 的條帶(圖 3-1)，帶的回收，連接轉(zhuǎn)化，，得到大量白斑菌落，隨機(jī)測(cè)，在將 PCR 檢測(cè)陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行不同的酶切組獲得 50 個(gè)陽(yáng)性重組子，隨機(jī)選 20 個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10bp

1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 13 14 M 15 16 17 18 19圖 3-2 陽(yáng)性重組子用 Hind Ⅲ和 BamHⅠ酶切圖譜M：DL2000marker；1-19：陽(yáng)性重組子質(zhì)粒 DNA 酶切Fig.3-2 The digestion products analysis using Hind Ⅲ and BamHⅠp→M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M圖 3-3 陽(yáng)性重組子用 EcoRⅠ和 HindⅢ酶切圖譜M：DL2000marker；1-18：陽(yáng)性重組子質(zhì)粒 DNA 酶切Fig.3-3 The digestion products analysis using EcoRⅠand HindⅢ
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S436.429

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 成曉靜;周楚奇;周麗英;卜璐璐;洪健康;楊正安;;三種黑籽南瓜RAPD分析[J];北方園藝;2015年17期

2 喬永旭;;黃瓜和黑籽南瓜幼苗RBCs對(duì)低溫脅迫的應(yīng)答差異[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2015年04期

3 趙芹;謝大森;何曉明;羅少波;彭慶務(wù);;基于NBS-LRR類(lèi)R基因保守結(jié)構(gòu)域克隆瓠瓜抗病基因同源序列[J];華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2015年05期

4 喬永旭;;黃瓜和黑籽南瓜幼苗根系邊緣細(xì)胞對(duì)肉桂酸脅迫的應(yīng)答差異[J];園藝學(xué)報(bào);2015年05期

5 喬永旭;張永平;高麗紅;;根系邊緣細(xì)胞對(duì)肉桂酸脅迫下黃瓜和黑籽南瓜活性氧代謝與根系活力的影響[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年08期

6 郝園園;江雪飛;;NaHS對(duì)NaHCO_3脅迫下黑籽南瓜及黃瓜種子生理指標(biāo)的影響[J];福建農(nóng)業(yè);2015年03期

7 朱友銀;王月;張弘;邵Y

本文編號(hào)：2632116