【摘要】：近年來苜蓿斑點病發(fā)生嚴重,經(jīng)取樣鑒定該病害由病原真菌引起。為了研究不同品種間抗病感病差異,本論文以21個品種的紫花苜蓿為試驗材料,綜合田間試驗、實驗室離體葉片試驗和苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活性綜合分析,作出抗性評價。在此基礎上,為了進一步探究抗病機制,利用紫外分光光度計和熒光定量PCR儀對紫花苜蓿不同抗性品種響應病原菌不同時間階段相關酶活性及基因表達的影響初步分析,為之后深入抗病機理研究奠定基礎。結果如下:1、分別利用引物ITS1/ITS4和OPA2-1R/OPA2-1F擴增出真菌核糖體ITS片段(547bp)和OPA2-1片段(599bp),經(jīng)過Genbank 比對結果均為交鏈格孢(Alternaria alternata)。2、通過模糊隸屬函數(shù)法綜合大田侵染實驗的病情指數(shù)、離體葉片實驗的病情指數(shù)和PAL相對酶活性指標進行評價,對21個紫花苜蓿品種進行抗病性強弱的排序分別為英斯特MT4015北林201Tango威神皇冠巨能9953010斯貝德Dryland4020巨能2巨能801巨能601巨能7-耐望維多利亞巨能7肇東耐鹽之星準葛爾新疆大葉。3、以新疆大葉、北林201、皇冠、耐鹽之星為實驗材料研究0-18d抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活性變化規(guī)律。試驗結果表明,接菌后O-6d是苜蓿APX、CAT、POD抗氧化酶響應交鏈格孢菌的關鍵時間:CAT、APX酶活性降低,可使H2O2短時間內積聚,放大逆境脅迫的信號分子;POD酶活性升高,將清除過高濃度的H2O2以保護細胞免受傷害。6-18d,APX、CAT酶活性總趨勢降低,推測由于持續(xù)的環(huán)境脅迫,造成細胞膜脂過氧化程度加深,從而影響了細胞內蛋白質等物質的合成。4、以新疆大葉、北林201為實驗材料研究0-72h抗氧化酶基因APX、CuZnSOD、MnSOD和抗病相關基因PAL、NPR1、NPR1L的相對表達量變化規(guī)律。根據(jù)qRT-PCR分析結果顯示,苜蓿葉片中APX、MnSOD、PAL基因的相對表達量顯著增加,不同抗感病苜蓿的MnSOD、CuZnSOD、NPR1、NPR1L基因相對表達量變化差異顯著,推測這些基因參與了紫花苜蓿對鏈格孢菌的早期抗性反應。
【圖文】：

用真菌核糖體內轉錄間隔區(qū)通用引物ＩＴＳ邋１邋（５＇ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧ４（５，－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３’邋）（Ｗｈｉｔｅ邋ＴＪ．Ｂｒｕｎｎｓ邋Ｔ．ｅｒ邋ａ／．，１９９０）、孢特異引物邋ＯＰＡ２－１Ｒ邋（５’邋－ＴＧＣＣＧＡ邋ＧＣＴＧＴＣＡＧＡＴＡＡＴＴＧ－３’）和邋Ｏ－ＧＣＣＧＡＧ邋ＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＧＡＧＴ－３’）進行邋ＰＣＲ邋擴增（Ｐｅｅｖｅｒ邋ＴＬ．邋Ｃａｓ邋Ｌ，Ｗ邋“／．，，２００５）。ＰＣＲ邋反應體系為邋２５邋ｌｉＬ，２ＸＴａｑ邋Ｍａｓｔｅｒ邋Ｍｉｘ邋１２．５ｕｌ為ｌｕｌ，上下引物各１邋ｕＬ，ｄｄＨ２０邋９．５ｕｌ。反應程序為９４°Ｃ預變性３ｍｉｎ，０ｓ，邋５６°Ｃ退火３０ｓ，邋７２°Ｃ延伸ｌｍｉｎ，邋３５個循環(huán)，７２°Ｃ延伸５ｍｉｎ。逡逑Ｒ產(chǎn)物經(jīng)１．０％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。引物由北京天一輝遠生物科技，擴增產(chǎn)物送該公司測序，測序結果在ＮＣＢＩ數(shù)據(jù)庫中進行登錄和比對果與分析逡逑１．形態(tài)學鑒定逡逑地調查苜蓿斑點病發(fā)病情況，統(tǒng)計發(fā)病率；取苜蓿病葉回實驗室進行病顯微鏡下觀察真菌孢子形態(tài)進行鑒定（圖２－１）。逡逑

２．邋３．邋２．邋ＩＴＳ序列鑒定和０ＰＡ２－１序列鑒定結果逡逑以病原菌ＤＮＡ為模板，分別用ＩＴＳ１／ＩＴＳ４引物和ＯＰＡ２－１Ｌ／ＯＰＡ２－１Ｒ引物做ＰＣＲ逡逑擴增，電泳后紫外凝膠成像（圖２－２），條帶單一較亮，且無非特異性擴增條帶，將逡逑ＰＣＲ產(chǎn)物進行雙向測序。逡逑Ｍ邋（邋ＩＴＳ邋）（邋ＯＰＡ２－１邋）逡逑７２Ｓ２°邐１：逡逑５００逡逑圖２－２真菌基因組的ＤＮＡ電泳圖譜逡逑Ｆｉｇ．２－２邋ＤＮＡ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｐａｔｔｅｒｎ邋ｏｆ邋ｆｕｎｇａｌ邋ｇｅｎｏｍｉｃ逡逑通過分析ｒＤＮＡ－ＩＴＳ和ｒＤＮＡ－ＯＰＡ２－１測序比對的結果，基因序列長度分別為逡逑５４７ｂｐ和５９９ｂｐ，將得到的序列導入Ｇｅｎｂａｎｋ中進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)與鏈格孢中多逡逑個種的同源性達到９９％以上（表２－１，表２－２）。結合形態(tài)學特征確認致病菌是交鏈逡逑格孢菌如觀咖ａ／攸）。逡逑擴增的ＩＴＳ序列結果（５４７ｂｐ）：逡逑ＡＣＣＴＧＣＧＧＡＧＧＧＡＴＣＡＴＴＡＣＡＣＡＡＡＴＡＴＧＡＡＧＧＣＧＧＧＣＴＧＧＡＡＣＣＴＣＴＣＧＧ逡逑ＧＧＴＴＡＣＡＧＣＣＴＴＧＣＴＧＡＡＴＴＡＴＴＣＡＣＣＣＴＴＧＴＣＴＴＴＴＧＣＧＴＡＣＴＴＣＴＴＧＴＴＴＣＣＴＴ逡逑ＧＧＴＧＧＧＴＴＣＧＣＣＣＡＣＣＡＣＴＡＧＧＡＣＡＡＡＣＡＴＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＴＡＡＴＴＧＣＡＡＴＣＡＧＣ逡逑ＧＴＣＡＧＴＡＡＣＡＡＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＣＴＴＴＣＡＡＣＡＡＣＧＧＡＴＣＴＣＴＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡ逡逑ＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＧＣＡＧＣＧＡＡＡＴＧＣＧＡＴＡＡＧＴＡＧＴＧＴＧＡＡＴＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＡＧＴＧ逡逑ＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＴＣＴＴＴＧＡＡ
【學位授予單位】：北京林業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S435.4

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本文編號：2629676