【摘要】：有機(jī)磷農(nóng)藥因藥效好、種類(lèi)多等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛用于我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn),是目前使用量最廣的一類(lèi)農(nóng)藥。但隨著生產(chǎn)力的提高,有機(jī)磷農(nóng)藥的亂用、濫用等情況越來(lái)越嚴(yán)重,導(dǎo)致食品和環(huán)境中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量超標(biāo),對(duì)人類(lèi)健康造成了威脅,甚至出現(xiàn)多起有機(jī)磷農(nóng)藥中毒事件,故迫切需要開(kāi)發(fā)新技術(shù)以實(shí)現(xiàn)快速、靈敏檢測(cè)食品和環(huán)境中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。適配體因具有高親和性、成本低廉、靶標(biāo)范圍廣泛和易于化學(xué)修飾等特點(diǎn),在有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方面有著巨大的應(yīng)用潛能。因此有必要篩選得可識(shí)別多種有機(jī)磷農(nóng)藥的的適配體,為今后建立一種基于適配體的快速、靈敏檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法奠定基礎(chǔ)。本研究基于磁珠-SELEX技術(shù),篩選得到有機(jī)磷農(nóng)藥OP3的適配體,并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了考察。主要工作如下:1、選擇課題組自主合成的有機(jī)磷農(nóng)藥OP3和OP4作為候選靶標(biāo),將OP3和OP4分別和載體蛋白BSA、OVA偶聯(lián),得到四種偶聯(lián)產(chǎn)物OP3-BSA、OP3-OVA、OP4-BSA、OP4-OVA,以紫外光譜法初步判斷偶聯(lián)是否成功,隨后用生物質(zhì)譜法計(jì)算并比較四種偶聯(lián)產(chǎn)物的偶聯(lián)比。發(fā)現(xiàn)OP3-BSA的偶聯(lián)比最高,更有利于篩選,因此選擇OP3作為靶標(biāo)進(jìn)行篩選。2、通過(guò)碳二亞胺法將偶聯(lián)比最高的OP3-BSA固定在氨基磁珠上用于正篩選,將BSA固定在氨基磁珠上用于反篩選。將OP3-BSA-Beads和初級(jí)單鏈DNA(ssDNA)文庫(kù)混合,于室溫下反應(yīng)45 min,隨后用結(jié)合緩沖液洗去未結(jié)合的ssDNA。用洗脫緩沖液在95 ℃條件下將結(jié)合到OP3-BSA-Beads上的ssDNA洗脫。將洗脫下來(lái)的ssDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,隨后將擴(kuò)增后的雙鏈DNA(dsDNA)解鏈成ssDNA,并制成次級(jí)文庫(kù)用于下一輪篩選。篩選共進(jìn)行19輪,并利用BSA作為負(fù)靶標(biāo),進(jìn)行了六輪反篩選,以除去與BSA具有親和性的ssDNA。通過(guò)測(cè)定每輪文庫(kù)中與OP3具有親和性的ssDNA的富集情況,選出第14輪的文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序,并用mfold軟件對(duì)測(cè)序豐度大于30的序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬,經(jīng)過(guò)分析比較,得到共16條適配體序列。3、對(duì)這16條序列的親和性進(jìn)行初步表征,選出親和性最高的4條適配體PES11、PES19、PES20、PES21進(jìn)行解離常數(shù)(Kd)的測(cè)定。它們的 Kd 值分別為 276±13.4nM、28.99±4.57nM、28.85±3.3OnM、45.30±4.24 nM,說(shuō)明這四條適配體都對(duì)OP3具有很高的親和性。4、評(píng)價(jià)了這四條適配體對(duì)OP3、倍硫磷、對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷、殺螟松、豐索磷、辛硫磷的結(jié)合能力,發(fā)現(xiàn)它們均能與至少兩種農(nóng)藥結(jié)合,其中PES11能與上述七種農(nóng)藥結(jié)合,對(duì)農(nóng)藥的識(shí)別范圍最廣。
【圖文】：

經(jīng)過(guò)多輪以上篩選程序，即可得到對(duì)靶標(biāo)具有高親和性的核酸適配體。逡逑１．３．２邐ＳＥＬＥＸ邋的過(guò)程逡逑ＳＥＬＥＸ技術(shù)的基本流程圖如圖１－１所示。步驟如下：（１）通過(guò)分子生物學(xué)原理逡逑在體外化學(xué)合成庫(kù)容量為１0１３－１0１５的隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)［５３］，文庫(kù)的寡核苷酸序列一般逡逑由位于兩端的固定序列和位于中間的隨機(jī)序列組成，其中固定序列的作用是作為ＰＣＲ逡逑擴(kuò)增階段引物的結(jié)合位點(diǎn)，隨機(jī)序列的作用是提供文庫(kù)的隨機(jī)性和多樣性，隨機(jī)序列逡逑一般含２０－６０個(gè)堿基。（２）在特定的緩沖體系下，將寡核苷酸文庫(kù)與靶標(biāo)進(jìn)行孵育。逡逑（３）通過(guò)特定的分離方法，如洗滌等，將寡核苷酸－靶標(biāo)復(fù)合物與未結(jié)合／微弱結(jié)合的逡逑寡核苷酸分開(kāi)。（４）通過(guò)特定的分離方法，如高溫洗脫等，將寡核苷酸從寡核苷酸－靶逡逑標(biāo)復(fù)合物中分離。（５）將分離的寡核苷酸進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，以達(dá)到對(duì)特異性寡核苷酸進(jìn)逡逑行富集的目的。（６）將擴(kuò)增后的雙鏈ＤＮＡ產(chǎn)物再次制成單鏈ＤＮＡ

Ｆｉｇ．２－１邋ＵＶ邋Ｓｃａｎｎｉｎｇ邋Ｓｐｅｃｔｒａ邋ｏｆ邋ＯＰ３，，邋ＢＳＡ邋ａｎｄ邋ＯＰ３－ＢＳＡ逡逑注：１邋為邋ＯＰ３邋，邋２邋為邋ＢＳＡ邋，邋３邋為邋ＯＰ３－ＢＳＡ逡逑如圖２－１所示，偶聯(lián)產(chǎn)物ＯＰ３－ＢＳＡ的紫外吸收曲線(xiàn)與其相應(yīng)的載體蛋白ＢＳＡ及逡逑有機(jī)磷農(nóng)藥ＯＰ３具有明顯差異，且兼具兩者的特征吸收峰。根據(jù)該現(xiàn)象，可初步判斷逡逑ＯＰ３與載體蛋白ＢＳＡ偶聯(lián)成功。逡逑１６逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京化工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：TQ450.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

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本文編號(hào)：2619786