【摘要】：DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾方式是植物響應(yīng)逆境脅迫的一種重要分子機(jī)制,有研究表明植原體侵染影響植物DNA甲基化動(dòng)態(tài)的調(diào)控,但植物在響應(yīng)植原體侵染過程中DNA甲基化的變化和調(diào)控機(jī)制還不清楚。本研究以健康和黃化型萎縮病發(fā)病(感病)桑樹葉片為研究對(duì)象,采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和甲基化修飾依賴性內(nèi)切酶測(cè)序(Methylation-dependent restriction-site associated DNA sequencing,Methyl RAD-Seq)技術(shù),對(duì)桑樹在響應(yīng)植原體侵染過程中轉(zhuǎn)錄組和基因組DNA甲基化水平變化進(jìn)行了聯(lián)合分析,篩選出了DNA甲基化調(diào)控的差異表達(dá)基因,并對(duì)其功能進(jìn)行了研究,初步闡明DNA甲基化在桑樹響應(yīng)植原體侵染過程中對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用。具體研究結(jié)果如下:(1)桑樹響應(yīng)植原體侵染過程中的轉(zhuǎn)錄組分析成功構(gòu)建了感病桑樹與健康桑樹葉片的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù),并進(jìn)行了高通量測(cè)序分析,鑒定得到2 722個(gè)差異表達(dá)基因,其中在感病葉片中上調(diào)的有1 701個(gè),下調(diào)的1 021個(gè)。利用KEGG Pathway分析,差異表達(dá)基因被富集到154條代謝通路,主要包括代謝、激素合成、信號(hào)傳導(dǎo)等代謝調(diào)控通路。(2)桑樹響應(yīng)植原體侵染過程中基因組DNA甲基化差異分析利用Methyl RAD-Seq技術(shù)對(duì)感病與健康桑樹葉片基因組的DNA甲基化水平進(jìn)行分析,共鑒定得到34 595個(gè)甲基化位點(diǎn),有5 042個(gè)甲基化位點(diǎn)在感病與健康桑樹基因組中存在差異,其中有3 676個(gè)CCGG甲基化差異位點(diǎn),在感病桑樹葉片中甲基化水平升高的CCGG位點(diǎn)有1 990個(gè),甲基化水平降低的位點(diǎn)有1 686個(gè),由935個(gè)基因被檢測(cè)到包含CCGG甲基化差異位點(diǎn);另外還鑒定得到1 366個(gè)CCNGG甲基化差異位點(diǎn),其中在感病桑樹葉片中甲基化水平升高的位點(diǎn)818個(gè),甲基化水平降低的位點(diǎn)548個(gè),由347個(gè)基因被檢測(cè)到包含CCNGG甲基化差異位點(diǎn)。(3)桑樹響應(yīng)植原體侵染過程中的DNA甲基化水平與基因表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)分析將篩選出的DNA甲基化差異基因和mRNA差異表達(dá)基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)有55個(gè)基因的表達(dá)水平與甲基化水平均存在顯著差異,這些差異表達(dá)基因中包括了45個(gè)CCGG甲基化位點(diǎn)和10個(gè)CCNGG甲基化位點(diǎn),有35個(gè)基因在感病桑樹中甲基化水平與轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢(shì)一致,有20個(gè)呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)。DNA甲基化程度和基因表達(dá)豐度都存在差異的基因包括6個(gè)抗病相關(guān)基因,以及多種與植物代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等相關(guān)的基因。通過定量PCR技術(shù)和CHOP-PCR技術(shù)分別對(duì)差異表達(dá)基因的mRNA表達(dá)豐度和DNA甲基化水平進(jìn)行了驗(yàn)證,證明了高通量測(cè)序結(jié)果的可靠性。(4)篩選出的與植物抗病性相關(guān)的候選基因的功能分析根據(jù)聯(lián)合分析的結(jié)果,選出了與抗病相關(guān)的兩個(gè)差異表達(dá)基因抗病蛋白基因(Mul-RPM1)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因(Mul-STK),對(duì)其生物功能進(jìn)行了分析。利用PCR技術(shù)分別克隆得到了Mul-RPM1和Mul-STK基因,亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)Mul-RPM1和Mul-STK均定位在質(zhì)膜區(qū)域。Mul-RPM1和Mul-STK基因的表達(dá)均受到水楊酸和桑樹病原菌的誘導(dǎo),DNA甲基化水平也受病原菌侵染影響,但其DNA甲基化水平不受水楊酸處理的影響。分別構(gòu)建兩基因的植物表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化擬南芥,篩選獲得其轉(zhuǎn)基因植株,發(fā)現(xiàn)兩基因在擬南芥中超表達(dá)都可提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)Pst.DC3000抗性。因此,桑樹Mul-RPM1和Mul-STK甲基化水平的變化可能影響兩基因的表達(dá),對(duì)植物的抗病性具有調(diào)控作用。以上研究結(jié)果有助于深入研究桑樹Mul-RPM1和Mul-STK基因的功能及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制,為從DNA甲基化修飾水平上揭示桑樹黃化型萎縮病的發(fā)生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖；X 軸表示堿基長(zhǎng)度范圍；Y 軸表示在該長(zhǎng)度區(qū)域的 Uniibution map; X axis represents base length range; Y axis represents uni圖 3-1 轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度分布圖Figure 3-1 Length distribution map of transcripts注釋轉(zhuǎn)錄組序列與七大功能數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，在 Nr、Swiss別注釋到 28 820、21 219、6 185、16 279、18 44945.97%、13.40%、35.27%、39.97%，在各數(shù)據(jù)庫(kù)見圖 3-2。

換后的平均表達(dá)水平），Y 軸代表 M 值（log2 轉(zhuǎn)換后的差異倍數(shù)alue A and the Y axis represents value M. Gray represents non-DEG.圖 3-5 差異基因的 MA-plot 分布圖Figure 3-5 MA-plot distribution map of differential genes下降，Y 軸代表差異基因數(shù)目。紅色代表上調(diào)的差異基因數(shù)目，，
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S888

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2611351