發(fā)布時(shí)間：2020-03-29 22:45

【摘要】：'陽光玫瑰'(Vlabruscana Bailey×V.vinifera L.Shine Muscat)是近年興起的一種鮮食二倍體歐美雜交種葡萄。該品種是日本果樹所經(jīng)'安云津21號'(Akitsu-21)×'白南'(Hakunan V.vinifera)雜交選育而來。該品種呈黃綠色,果皮薄而果肉硬脆,正常栽培管理下可溶性固形物能達(dá)20%,具有諸多優(yōu)良性狀。但'陽光玫瑰,在我國各地栽培中普遍表現(xiàn)類似病毒病癥狀,包括葉片反卷、畸形、透明斑等等,對果實(shí)產(chǎn)量、質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。為此本研究展開了針對'陽光玫瑰'病毒病原鑒定,并探究高效的檢測方法;探究適合'陽光玫瑰'的組織培養(yǎng)體系和脫毒技術(shù)。主要研究結(jié)果如下:1.不同果園'陽光玫瑰'樹體調(diào)查發(fā)現(xiàn)類病毒病癥狀主要表現(xiàn)在葉片上,葉片表現(xiàn)不同類型的畸形,包括泡狀皺縮、皺縮畸形、塔狀畸形、葉緣反卷等。春季萌發(fā)后當(dāng)年扦插苗、兩年生幼樹較多年生樹容易表現(xiàn)癥狀,但是樹勢較旺的樹體上一般至開花前均不表現(xiàn)癥狀,在掛果后至落葉前病樹會大量表現(xiàn)病癥。2.應(yīng)用RT-PCR檢測及核苷酸序列測定技術(shù)進(jìn)行病原鑒定選定的10個(gè)品種調(diào)查樣品中含有葡萄灰比諾病毒(GVPV)、葡萄卷葉伴隨3型病毒(GLRaV-3)、葡萄斑點(diǎn)病毒(GFkV)、沙地葡萄莖痘相關(guān)病毒(GRSPaV)、葡萄病毒B(GVB)、葡萄病毒E(GVE)這6種病毒。其中'陽光玫瑰'含有GLRaV-3、GFkV、GRSPaV、GVB、GVE這5種病毒,且其檢出率均高于平均檢出率,5種病毒復(fù)合感染率達(dá)36.36%。3.優(yōu)化模板濃度、引物濃度、聚合酶濃度等參數(shù),建立了葡萄皺木復(fù)合病相關(guān)病毒GRSPaV、GVB、GVE的多重RT-PCR檢測體系,即包含TaqMix 6 ul、模板cDNA1μl、GRSPaV對應(yīng)特異性上下游引物各0.6μl、其他引物各0.4μl的10μl體系;以及引起葡萄葉片畸形的相關(guān)病毒GVPV、GLRaV-3、GFkV的多重RT-PCR檢測體系,即包含TaqMix 6 ul、模板cDNA1μl、GLRaV-3對應(yīng)特異性上下游引物各0.6μl、其他引物各0.4μl的10μl體系。4.'陽光玫瑰'單芽莖段為外植體的組織培養(yǎng)快速繁殖體系建立。無菌環(huán)境下離體培養(yǎng)誘使定芽萌發(fā)成株,其中外植體最佳消毒處理為0.1%氯化汞處理12 min,成活率為51.7%;最適莖段初代培養(yǎng)基激素水平為0.5mg/L6-BA+0.5mg/L KT,萌發(fā)率為56.2%;最適繼代培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L6-BA,增殖率為1.89;最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.5mg/LNAA。5.'陽光玫瑰,莖尖組織培養(yǎng)體系建立。采用莖尖組織誘導(dǎo)再生的方法,其中外植體最佳消毒方案為0.1%氯化汞處理8 min,0.1 mm大小的外植體成活率為 64.4%;最適莖尖初代培養(yǎng)基為 1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.2 mg/L IBA。6.'陽光玫瑰'葡萄脫毒健康種苗創(chuàng)制。采用多種脫毒方法,包括莖尖組織培養(yǎng)、熱處理脫毒、熱處理結(jié)合莖尖組織培養(yǎng)、超低溫處理結(jié)合莖尖組織培養(yǎng)。其中熱處理結(jié)合莖尖組織培養(yǎng)優(yōu)于其他方法,表現(xiàn)最佳,再生率為90%,GLRaV-3、GFkV、GRSPaV、GVB、GVE 的脫毒率分別為 100.0%、80.0%、95.0%、70.0%、45.0%。
【圖文】：

比較退火溫度為５０°Ｃ與５５°Ｃ的多組不同體系多重ＲＴ－ＰＣＲ反應(yīng)均無明顯差逡逑異，但是引物濃度的變化區(qū)別明顯。退火溫度為５５°Ｃ的條件下，比較不同模板逡逑量、引物和Ｔａｑ酶濃度的７種組合的多重ＲＴ－ＰＣＲ反應(yīng)（圖２．２，圖２．３），發(fā)現(xiàn)逡逑適當(dāng)增加Ｔａｑ酶濃度并調(diào)節(jié)引物濃度可以有效優(yōu)化多重ＲＴ－ＰＣＲ體系。在逡逑ＧＲＳＰａＶ、ＧＶＢ、ＧＶＥ的多重檢測中，最佳組合采用包含ＴａｑＭｉｘ邋６邋ｕｌ、模板ｃＤＮＡ逡逑１邋Ｈｉ、ＧＲＳＰａＶ對應(yīng)特異性上下游引物各０．６卟其他引物各０．４邋ｎｌ的１０邋ｐｉ體系；逡逑在ＧＶＰＶ、ＧＬＲａＶ－３、ＧＦｋＶ的多重檢測中，最佳組合采用包含ＴａｑＭｉｘ６ｕｌ、模逡逑板ｃＤＮＡ邋１…、ＧＬＲａＶ－３對應(yīng)特異性上下游引物各０．６邋０、其他引物各０．４山的逡逑１０Ｍ體系。逡逑１９逡逑

邐９７％逡逑３．４．２實(shí)時(shí)熒光定量檢測結(jié)果逡逑由圖２．４、２．５可以看出，，５月至９月間在調(diào)查樣本中ＧＲＳＰａＶ、ＧＬＲａＶ－３、逡逑ＧＶＢ、ＧＶＥ、ＧＦｋＶ含量均表現(xiàn)出季節(jié)性的變化。檢測到的ＧＲＳＰａＶ的最高含量逡逑遠(yuǎn)高于其他病毒，其含量呈現(xiàn)先上升再下降的變化，在７月達(dá)到峰值；０0＾％逡逑３、ＧＶＥ、ＧＦｋＶ同樣呈現(xiàn)先上升再下降的變化，在６月達(dá)到峰值；ＧＶＢ含量則逡逑是在該期間不斷下降。實(shí)時(shí)熒光定量的定性檢測結(jié)果與ＲＴ－ＰＣＲ檢測結(jié)果一致率逡逑為邋７５＿５６％。逡逑－Ａ—ＧＲＳＰａＶ逡逑＿邋１４００逡逑Ｊ邋１２００邐Ａ逡逑汾�。姡姡苠义希渝澹卞澹叮埃斑姡姡苠义希洛澹靛澹矗埃斑姡姡苠义希捱姡斑姡铃义希靛骞停幔姡对拢剩酰钸姡峰逶拢剩酰爝姡稿逶拢粒酰邕姡瑰逶拢樱澹疱义蠄D２．４邋ＧＲＳＰａＶ實(shí)時(shí)熒光定量檢測結(jié)果逡逑Ｆｉｇ２．４邋Ｒｅｓｕｌｔｓ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ邋ＰＣＲ邋ｉｎ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＧＲＳＰａＶ逡逑２１逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S436.631.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2606618