本文關(guān)鍵詞：一種核酸提取磁球和四種腦炎病毒核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）的研制

  更多相關(guān)文章： Fe_3O_4@SiO_2 磁性復(fù)合微球 核酸提取 熒光PCR

【摘要】：目的1、研制一種分散性好、磁響應(yīng)能力強(qiáng)、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定和機(jī)械強(qiáng)度高的高性能Fe_3O_4@SiO_2磁性復(fù)合微球,不僅可用于不同病原微生物核酸的提取,還可以配合核酸提取儀快速、自動(dòng)提取和純化DNA;2、為提高對近年來頻繁爆發(fā)的蟲媒傳染病的預(yù)防與檢測能力,分別研發(fā)腦膜炎癥候群病毒中可造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重感染的東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒和森林腦炎病毒核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)。方法1、首先,采用水熱合成法,以NaAc為靜電穩(wěn)定劑,乙二醇為還原劑,聚乙二醇為表面活性劑,FeCl_3·6H_2O為原料,在高溫高壓條件下反應(yīng)合成四氧化三鐵磁性納米微球;其次,在超聲波輔助的條件下,通過St?ber合成法在磁性微球表面快速包覆一層均勻二氧化硅,并通過調(diào)節(jié)投入反應(yīng)體系中的正硅酸乙酯(TEOS)的量來控制Fe_3O_4磁性微粒表面包覆的二氧化硅殼層的厚度,進(jìn)而制備一系列具有不同二氧化硅殼層厚度的Fe_3O_4@SiO_2磁性復(fù)合微球;然后通過透射電鏡(TEM)、超導(dǎo)量子干涉磁強(qiáng)計(jì)(SQUID)對Fe_3O_4@SiO_2磁性復(fù)合微球的基本性能進(jìn)行表征,最終通過提取鮭魚精DNA溶液、乙肝病毒血清稀釋樣本及質(zhì)粒菌稀釋樣本,驗(yàn)證其對不同樣本DNA的提取效果。2、四種腦炎病毒核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)的技術(shù)路線主要分為三部分:(1)引物探針的設(shè)計(jì)與篩選。通過文獻(xiàn)調(diào)研確定目標(biāo)病原體的靶基因,從genebank數(shù)據(jù)庫中下載相應(yīng)病原體靶基因的基因序列并進(jìn)行比對分析,設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光PCR的引物和TaqMan探針;收集標(biāo)準(zhǔn)病毒株樣本,建立質(zhì)粒參考品和體外轉(zhuǎn)錄RNA參考品,對無樣本的腦炎病毒通過重疊延伸法人工合成靶基因后建立質(zhì)粒參考品;制備靈敏度和特異性參考品,完成引物和探針的篩選。(2)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化。重點(diǎn)優(yōu)化PCR過程的退火溫度和退火時(shí)間。(3)試劑盒綜合性能評價(jià)。以陽性參考品和陰性參考品評價(jià)核酸檢測試劑盒的特異性。以靈敏度參考品評價(jià)其核酸檢測試劑盒的最低檢出限。檢測實(shí)際臨床樣本或模擬病毒樣本評價(jià)核酸檢測試劑盒的使用效果。結(jié)果1、水熱法制備出粒徑為400~500nm的Fe_3O_4磁性微球,通過進(jìn)一步合成反應(yīng),制備出三種不同二氧化硅殼層厚度的Fe_3O_4@SiO_2磁性復(fù)合微球T50、T100、T150。透射電鏡顯示,二氧化硅平均厚度由薄至厚依次為20nm、40nm、65nm。超導(dǎo)量子干涉磁強(qiáng)計(jì)測得包硅后的飽和磁化強(qiáng)度可達(dá)62.5emu/g。乙肝病毒DNA提取實(shí)驗(yàn)表明中等厚度的Fe_3O_4@SiO_2磁性復(fù)合微球(T100)提取DNA后擴(kuò)增的Ct值最小,表明T100磁珠的提取效果最好。對不同濃度的鮭魚精DNA溶液提取實(shí)驗(yàn)表明,T100磁性復(fù)合微球的效率可達(dá)85%以上。磁珠用量與洗脫時(shí)間的實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)磁性復(fù)合微球?yàn)?mg,洗脫時(shí)間10min時(shí),可達(dá)到最佳提取效果。提取不同濃度乙肝病毒DNA時(shí),與商業(yè)化磁珠試劑盒相比,T100磁性復(fù)合微球具有更好的提取效率。此外,T100磁性復(fù)合微球?qū)|(zhì)粒DNA也有良好的提取效果。2、首先,根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研確定了東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒和森林腦炎病毒的靶基因。根據(jù)基因序列比對結(jié)果,分別設(shè)計(jì)了2-3對引物及3-5條探針。構(gòu)建了質(zhì)粒參考品。以病毒質(zhì)粒參考品為模板制備了四種病毒的體外轉(zhuǎn)錄RNA作為靈敏度參考品。其次篩選出四種蟲媒腦炎病毒的引物與探針。然后分別優(yōu)化了每種腦炎病毒PCR反應(yīng)參數(shù)以保證其靶基因能良好的擴(kuò)增。最后,對核酸檢測試劑盒的綜合性能進(jìn)行了評價(jià)。特異性評價(jià)結(jié)果表明核酸檢測試劑盒可很好的區(qū)分同種屬病毒。靈敏度評價(jià)結(jié)果表明四種腦炎病毒核酸檢測試劑盒的最低檢出限為10~2copies/μl。結(jié)論1、成功制備了一種分散性好、磁響應(yīng)能力強(qiáng)、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定和機(jī)械強(qiáng)度高的高性能Fe_3O_4@SiO_2磁性復(fù)合微球,不僅可用于不同病原微生物核酸的提取,還可以運(yùn)用于核酸提取儀,快速、自動(dòng)提取和純化DNA。2、成功研制出東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、森林腦炎病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR法核酸檢測試劑盒,為這四種腦炎病毒的預(yù)防和控制提供了新的檢測方法。
【關(guān)鍵詞】：Fe_3O_4@SiO_2 磁性復(fù)合微球 核酸提取 熒光PCR
【學(xué)位授予單位】：河南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R440
【目錄】：

• 中英文對照表5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-17
• 實(shí)驗(yàn)1 一種核酸提取磁球的制備17-28
• 1 材料和儀器17
• 2 方法17-21
• 3 結(jié)果21-28
• 實(shí)驗(yàn)2 四種腦炎病毒核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）的研制28-42
• 1 材料與儀器28-29
• 2 方法29-36
• 3 結(jié)果36-42
• 討論42-44
• 結(jié)論44-45
• 致謝45-46
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 附錄一：文獻(xiàn)綜述 核酸提取方法及其研究進(jìn)展49-55
• 參考文獻(xiàn)53-55
• 附錄二：在校期間論文論著和科研情況55

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