本文關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌的流式細胞術(shù)檢測方法研究

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【摘要】：金黃色葡萄球菌是重要的食源性致病菌之一,由其引起的食源性疾病已引起了全世界的高度重視。金黃色葡萄球菌的快速檢測是預防和控制細菌性食物中毒的有效手段。傳統(tǒng)的檢測方法需要進行細菌分離培養(yǎng)和一系列繁瑣的生化實驗鑒定,較為費時費力,不能滿足快速檢測的需求。流式細胞術(shù)(Flow Cytometry,FCM)是一種集光學、電子學、免疫學等為一體的檢測技術(shù),可快速針對懸浮于液相環(huán)境中單個細菌或微球進行多參數(shù)定性和定量分析,現(xiàn)已廣泛應用于細菌的常規(guī)工作和微生物學研究中。如:對微生物污染的水和食品樣本進行細菌的快速計數(shù)、聯(lián)合使用熒光染色的特異性配體鑒別目標細菌、通過制備配體功能化微球建立多重檢測方法等。用于細菌檢測的配體主要為抗體和適配體(aptamer)。適配體是一類利用SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)技術(shù)篩選獲得的核酸小分子,其作用原理與抗體相似,但相比抗體具有許多優(yōu)勢:化學穩(wěn)定性強、篩選獲得周期短、易于修飾、便于結(jié)合其他檢測方法構(gòu)建生物傳感器等。但是高親和力的、可直接用于實際應用的適配體很難篩選獲得。因此,構(gòu)建生物檢測傳感器時,應謹慎選擇抗體或適配體作為配體,必要時也可兩者聯(lián)和使用。本課題旨在利用流式細胞術(shù),建立基于配體識別的金黃色葡萄球菌檢測方法,并對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157:H7的同時檢測進行了探索性試驗。運用流式細胞術(shù)分別建立了基于適配體識別的金黃色葡萄球菌檢測方法和基于配體識別的金黃色葡萄球菌液相芯片檢測方法。具體研究內(nèi)容如下:(1)基于適配體識別的金黃色葡萄球菌流式細胞術(shù)檢測方法研究以金黃色葡萄球菌為研究對象,使用FAM熒光素標記的金黃色葡萄球菌特異性適配體SA17識別細菌,流式細胞術(shù)分析有熒光適配體結(jié)合的陽性細菌百分比。通過優(yōu)化適配體折疊方式、適配體檢測濃度,建立基于適配體識別的檢測方法,并對建立的方法進行靈敏度驗證。最后使用兩種不同熒光素標記的配體同時對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157:H7的檢測進行了探索性試驗。為方便圈選細菌群體進行下一步分析,調(diào)節(jié)流式細胞儀FSC/SSC電壓為對數(shù)模式。FAM熒光素標記的適配體SA17與金黃色葡萄球菌孵育結(jié)合,比較常見的4種核酸折疊方式對適配體檢測效果的影響。分析顯示單因素方差分析具有方差齊次性,4種折疊方式的適配體檢測效果有顯著性差異。LSD法兩兩比較顯示未經(jīng)高溫變性折疊的適配體與其他3種折疊方式的檢測效果相比差異極顯著。以此折疊方式為基礎(chǔ)優(yōu)化適配體使用量,確定最佳工作濃度為250 nM。特異性分析顯示,FAM-SA17與大腸桿菌O157:H7無交叉結(jié)合。金黃色葡萄球菌培養(yǎng)至108 CFU以上后,運用FCM 40 min完成檢測,結(jié)果可靠。使用藻紅蛋白-鏈霉親和素-生物素標記的大腸桿菌O157:H7單克隆抗體和FAM熒光素標記的SA17對兩種細菌的混懸液進行檢測,流式細胞術(shù)分析顯示,由于大腸桿菌O157:H7單抗與金黃色葡萄球菌有非特異性結(jié)合,導致兩種配體不能實現(xiàn)對兩種菌的檢測。綠色熒光區(qū)域的陽性百分比與使用FAM-SA17單一檢測金黃色葡萄球菌時相比雖減小,但均為陽性結(jié)果。表明FAM-SA17可于兩種菌的混懸液中特異性識別金黃色葡萄球菌。(2)基于配體識別的金黃色葡萄球菌液相芯片檢測方法研究制備金黃色葡萄球菌多克隆抗體和適配體功能化的磁性微球,磁性分離、富集細菌,分別以金黃色葡萄球菌適配體和多克隆抗體作為檢測配體,運用FCM分析檢測配體的熒光信號,比較4種模式的液相芯片檢測結(jié)果。以基于金黃色葡萄球菌多克隆抗體的雙抗夾心液相芯片進行下一步研究,優(yōu)化檢測抗體工作濃度,對建立的方法進行特異性和靈敏度驗證。通過4種不同捕獲配體與檢測配體夾心的模式,比較液相芯片檢測結(jié)果,以試驗組的MFI/空白組的MFI≥3判定為陽性結(jié)果。結(jié)果顯示,僅當捕獲配體與檢測配體均為金黃色葡萄球菌多克隆抗體時,液相芯片檢測結(jié)果符合陽性判定標準。首先制備金黃色葡萄球菌抗體功能化羧基微球PSA-65,以此作為捕獲微球。然后通過對金黃色葡萄球菌多克隆抗體進行生物素標記,以此作為檢測抗體并優(yōu)化其使用量,最終確定工作濃度為12μg/m L。特異性和靈敏度驗證結(jié)果顯示,建立的方法與其他五種常見食源性致病菌(單增李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7、阪崎腸桿菌)無交叉結(jié)合反應,檢測限為106 CFU。參照上述方法建立大腸桿菌O157:H7的液相芯片檢測技術(shù)(大腸桿菌O157:H7抗體功能化羧基微球MEC-26),特異性結(jié)果顯示MEC-26與金黃色葡萄球菌無交叉反應,同時使用MEC-26與PSA-65對兩種目標菌的混懸液進行檢測(檢測抗體為兩種檢測抗體的混合物),與檢測單一目標細菌比較,PSA-65檢測結(jié)果保持一致,不受MEC-26和大腸桿菌O157:H7檢測抗體干擾。本研究運用流式細胞術(shù)建立了特異性配體識別的流式細胞術(shù)檢測方法和利用捕獲微球檢測的液相芯片檢測方法。使用特異性適配體FAM-SA17直接檢測金黃色葡萄球菌,不需進行折疊,大大縮短了適配體的前處理過程,檢測過程更加省時、便捷。液相芯片間接檢測方法,通過制備抗體功能化磁性微球進行磁性分離、富集細菌后,運用FCM分析熒光報告分子,結(jié)果更加真實、可靠。以上研究為食源性致病菌的檢測提供了新方法,并具有一定的應用前景。
【關(guān)鍵詞】：流式細胞術(shù) 液相芯片 金黃色葡萄球菌 適配體 檢測
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R446.5
【目錄】：

• 縮略詞表4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 第一章 前言10-17
• 1.1 食源性致病菌的危害10
• 1.2 常見的食源性致病菌檢測方法10-16
• 1.3 課題研究內(nèi)容和意義16-17
• 第二章 基于適配體識別的金黃色葡萄球菌流式細胞術(shù)檢測方法研究17-26
• 2.1 材料與設(shè)備17-18
• 2.2 方法18-19
• 2.3 結(jié)果19-23
• 2.4 討論23-24
• 2.5 小結(jié)24-26
• 第三章 基于配體識別的金黃色葡萄球菌液相芯片檢測方法研究26-40
• 3.1 材料與設(shè)備26-27
• 3.2 方法27-31
• 3.3 結(jié)果31-36
• 3.4 討論36-39
• 3.5 小結(jié)39-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻41-44
• 個人簡介44-45
• 致謝45

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 白潔;機組配餐員的金黃色葡萄球菌污染情況[J];國外醫(yī)學(衛(wèi)生學分冊);2002年02期

2 朱自強;;金黃色葡萄球菌更具殺傷力的原因在于其金黃色“外殼”[J];基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床;2005年11期

3 杜洪利;張雙雙;歐旭;閆訓友;;金黃色葡萄球菌檢測技術(shù)研究進展[J];食品與發(fā)酵科技;2009年05期

4 黃嶺芳;賴衛(wèi)華;張莉莉;;食品中金黃色葡萄球菌快速檢測方法的研究進展[J];食品與機械;2009年06期

5 王娉;勞華均;胡s，

本文編號：915638