發(fā)布時間：2017-09-02 14:37

  本文關鍵詞：利用染色體基因組上多拷貝16S rRNA基因鑒定耶爾森菌屬細菌的研究

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【摘要】：目的API20E生化鑒定系統(tǒng)是腸桿菌科細菌鑒定的金標準,但在耶爾森菌鑒定中,API20E生化鑒定試劑條所能鑒定的耶爾森菌種類有限,除鑒定的結果不穩(wěn)定外,不同種耶爾森菌還會出現(xiàn)相同的代謝譜,如弗氏耶爾森菌和中間型耶爾森菌具有相同的API20E生化編碼,因此還需要多種分子生物學方法作為輔助加以鑒別。16S rRNA(小核糖體RNA)基因常用于原核生物種屬的分類及鑒定。但16S rRNA基因在原核生物中為多拷貝基因,且不同拷貝之間存在異質性,使用單一拷貝16S rRNA基因進行物種鑒定會出現(xiàn)鑒定錯誤的情況。因此,我們欲通過結合耶爾森菌屬細菌內多個拷貝的16S rRNA基因信息,探討不同種耶爾森菌不同拷貝間的異質性及對系統(tǒng)發(fā)育鑒定的影響。方法本次研究從本實驗室選取744株耶爾森菌屬細菌,通過T載體克隆的方法,對每株菌隨機挑選5個16S rRNA基因克隆子,通過測序技術得到基因序列。對24株來自NCBI的全基因組測序株,采用用隨機數(shù)字表法,分別選取5條16S rRNA基因信息。然后結合所有菌株內5個16S rRNA基因信息,對768株菌建立系統(tǒng)發(fā)育樹,分析耶爾森菌屬細菌的分類情況。結果本研究共涵蓋了768株耶爾森菌屬細菌,共10個種,每株菌得到5條16S rRNA基因信息,所有菌株共3840條16S rRNA基因序列,按照一個堿基不同視為不同類型16SrRNA基因序列,共分為439個型別。分析每株菌的5個克隆子所包含的16S rRNA基因類型數(shù)發(fā)現(xiàn),60%菌株包括2-3個16SrRNA基因類型,18%菌株包括4個類型,17%的菌株只有1種16S rRNA類型,而五個克隆子均為不同類型的菌株所占比例最少,為5%；比較五種耶爾森菌種間菌株內16S rRNA基因種類,可以看出假結核耶爾森菌、克氏耶爾森菌種內16S rRNA基因類型集中在I-2種,弗氏／中間型耶爾森集中在2-4種,非致病性小腸結腸炎耶爾森菌16S rRNA基因類型集中在2-3種,致病小腸結腸炎耶爾森菌則集中在1-3種。5個克隆子全為同一類型的比例,在致病性小腸耶爾森菌為23.5%,非致病性小腸耶爾森菌僅為8.6%。在鼠疫耶爾森與假結核耶爾森中沒有發(fā)現(xiàn)5個克隆子均為不同種類型16S rRNA基因的菌株；比較耶爾森菌屬細菌內多個拷貝16S rRNA基因相似性發(fā)現(xiàn),同一菌株的5個拷貝16S rRNA基因相似度大部分在99%以上,有9株差異較大,低于98.7%。綜合菌株5條16S rRNA基因序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn),耶爾森菌種間的聚類結果基本與生化鑒定結果相符,大部分耶爾森菌能形成相應種內聚類群；使用此方法亦能區(qū)分用生化反應鑒定難以區(qū)分的弗氏耶爾森菌與中間型耶爾森菌；同時也發(fā)現(xiàn)有個別克氏耶爾森菌由于種內變異度高,有種間交叉聚類現(xiàn)象,但并不影響鑒定的整體趨勢。同時發(fā)現(xiàn),每種菌有其優(yōu)勢序列,部分種間有完全一致的16S rRNA基因序列。結論1、耶爾森菌屬細菌16S rRNA基因為多拷貝基因,大部分菌株不同拷貝間序列并不相同,個別菌株超過16S rRNA基因細菌鑒定閾值鑒,使用單個16S rRNA基因進行種類鑒定出現(xiàn)錯誤的機率會很大。2、通過綜合多個16S rRNA基因信息進行耶爾森菌種類鑒定,能夠在一定程度上提高耶爾森菌種間的鑒別力。3、擁有相同的16S rRNA基因的不同種耶爾森菌,在細菌鑒定時還需結合其他鑒定方法。
【關鍵詞】：耶爾森菌 16S rRNA基因 多拷貝 系統(tǒng)發(fā)育
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R516;R440
【目錄】：

• 英文縮寫對照表5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 引言10-16
• 1. 實驗材料與方法16-28
• 1.1 實驗儀器與材料16-18
• 1.1.1 實驗儀器16-17
• 1.1.2 主要生化試劑17
• 1.1.3 培養(yǎng)基與試劑配制17-18
• 1.2 參考菌株及參考序列來源18-19
• 1.3 實驗方法19-28
• 1.3.1 標本采集19-20
• 1.3.2 標本DNA的提取20-21
• 1.3.3 PCR初篩標本21-22
• 1.3.4 菌株分離培養(yǎng)22
• 1.3.5 生化鑒定與生物分型22-23
• 1.3.6 提取目的菌株核酸23-24
• 1.3.7 16S rRNA基因T載體克隆24-27
• 1.3.8 序列分析27-28
• 2. 結果與分析28-39
• 2.1 目的菌株分離情況28-32
• 2.2 16S rRNA基因類型數(shù)32-33
• 2.3 不同種耶爾森菌菌株內16S rRNA基因相似性比較33-34
• 2.4 16S rRNA基因序列聚類分析34-37
• 2.5 不同種耶爾森菌16S rRNA優(yōu)勢基因類型37
• 2.6 不同種間耶爾森菌的16S rRNA共有基因序列分布37-39
• 3. 討論39-46
• 參考文獻46-52
• 附錄一 綜述52-63
• 參考文獻59-63
• 附錄二 研究生期間論文發(fā)表情況63-64
• 致謝64

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1 白克敏;耶爾森菌屬假性結核桿菌感染癥與急性腎功能不全[J];國外醫(yī)學(兒科學分冊);1986年06期

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1 郝慧靜;利用染色體基因組上多拷貝16S rRNA基因鑒定耶爾森菌屬細菌的研究[D];中國疾病預防控制中心;2016年

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本文編號：779174