本文關(guān)鍵詞：基于石墨烯熒光淬滅作用的DNA甲基化及生物小分子分析方法的研究

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【摘要】：隨著醫(yī)療技術(shù)的提高,癌癥等惡性疾病的死亡率逐漸降低,癌癥等不再是不治之癥。而實現(xiàn)各種疾病的早期診斷和治療則是提高疾病患者生存率的關(guān)鍵。通過對基因與癌癥等基因相關(guān)的疾病的了解,從分子水平分析實現(xiàn)對各類疾病的早期診斷與治療具有重要的意義。熒光分析法是一種常用的分析檢測方法,具有靈敏度高、選擇性好、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。而各類熒光材料(如石墨烯和石墨烯量子點(diǎn))的發(fā)展使熒光傳感器檢測手段、檢測效果、應(yīng)用領(lǐng)域得到了顯著的提高和拓展。本文旨在基于石墨烯類材料特殊的熒光性能實現(xiàn)疾病DNA和生物小分子的熒光分析,為某些疾病的早期診斷和治療觀察提供快速、靈敏、精確的方法。本論文主要以DNA甲基化、去甲基化引起的惡性疾病基因和高鐵血紅素為研究對象,實現(xiàn)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化的分析以及高鐵血紅素的熒光分析方法。主要內(nèi)容如下：1、我們建立了一種基于氧化石墨烯熒光淬滅作用的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的分析方法。該方法中使用了一種包括與GO作用的結(jié)合區(qū)域和與目標(biāo)DNA雜交的感應(yīng)區(qū)域的特殊單鏈DNA探針。單鏈探針吸附于GO表面,與目標(biāo)DNA雜交經(jīng)限制性內(nèi)切酶HpaⅡ剪切后,FAM離開GO表面進(jìn)入溶液,熒光信號恢復(fù)。然而,雙鏈被M.SssⅠ甲基化后HpaⅡ無法剪切,熒光信號無明顯恢復(fù)且熒光信號恢復(fù)程度與M.SssⅠ濃度有關(guān)。實驗結(jié)果表明,FAM的熒光強(qiáng)度變化值與M.SssⅠ濃度對數(shù)值在0.1 U/mL到100 U/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,信噪比為3時最低檢測限為(0.03±0.01)U/mL。并且,該方法能靈敏地識別其它甲基轉(zhuǎn)移酶,具有良好的選擇性。該方法可避免由于非特異性吸附干擾物而產(chǎn)生虛假信號,且能有效用于MTase抑制劑的評估和篩選,有望用于抗癌藥物的發(fā)現(xiàn)。2、我們發(fā)展了一種基于MBD2去甲基酶和限制性內(nèi)切酶HpaⅡ相互作用體系來檢測特定CpG位點(diǎn)的DNA去甲基化,并且建立一種基于氧化石墨烯熒光淬滅作用分析MBD2的方法。實驗結(jié)果表明：MBD2檢測范圍可達(dá)到0.2-300ng/mL,最低檢測限是(0.05 ±0.01) ng/mL (S/N=3).該方法對MBD2活性分析具有良好的靈敏性和選擇性,并可用于復(fù)雜體系對DNA去甲基酶的檢測,有望成為檢測DNA去甲基水平的重要傳感方法,對生物醫(yī)學(xué)研究和早期臨床診斷等具有重要的參考價值。3、我們通過電化學(xué)方法合成硼摻雜石墨烯量子點(diǎn)(BGQDs),并成功將其應(yīng)用于高鐵血紅素(Hematin)的檢測。根據(jù)高鐵血紅素對BGQDs的高效熒光淬滅能力,可直接分析人類紅細(xì)胞中高鐵血紅素含量。其創(chuàng)新性在于本方法不僅可以實現(xiàn)高鐵血紅素的高靈敏、高選擇性分析,而且本方法可直接分析紅細(xì)胞中高鐵血紅素含量,避免了其它方法必須先分離血紅蛋白等操作。在0.01-0.92 μmol/L范圍內(nèi),高鐵血紅素濃度和熒光強(qiáng)度具有良好的線性關(guān)系,其最低檢測限為(0.005±0.001)μmol/L(S/N=3)。此外,本方法可用于健康型和鐮刀型紅細(xì)胞中高鐵血紅素含量的分析。結(jié)果表明,健康型和鐮刀型紅細(xì)胞中高鐵血紅素濃度分別是(23.1±4.9)μmol/L和(52.5±9.5)μmol/L。我們還結(jié)合電化學(xué)方法和DFT模擬計算研究了高鐵血紅素對BGQDs的熒光淬滅機(jī)理,從理論上闡明了本方法的可行性。該方法可實現(xiàn)紅細(xì)胞中高鐵血紅素直接、快速、靈敏、選擇性的分析,且無需標(biāo)記、操作簡單、成本低廉,對臨床檢查和疾病診斷等具有潛在的應(yīng)用價值。
【關(guān)鍵詞】：熒光檢測 石墨烯 BGQDs DNA甲基化和去甲基化 血紅素
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R446.1;O657.3
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 第一章 緒論9-25
• 1.1 引言9-10
• 1.2 石墨烯10-18
• 1.2.1 石墨烯概述10-11
• 1.2.2 石墨烯的制備11-14
• 1.2.3 石墨烯功能化14-15
• 1.2.4 石墨烯在生物領(lǐng)域的應(yīng)用15-18
• 1.3 石墨烯量子點(diǎn)18-24
• 1.3.1 石墨烯量子點(diǎn)概述18
• 1.3.2 石墨烯量子點(diǎn)的制備18-22
• 1.3.3 石墨烯量子點(diǎn)的應(yīng)用22-24
• 1.4 指導(dǎo)思想24-25
• 第二章 基于GO熒光淬滅作用的甲基轉(zhuǎn)移酶活性的分析及抑制劑的篩選25-37
• 2.1 引言25-27
• 2.2 實驗部分27-29
• 2.2.1 試劑27
• 2.2.2 GO的制備27-28
• 2.2.3 MTase活性分析28-29
• 2.2.4 M.SssI選擇性分析29
• 2.2.5 抑癌藥物的篩選29
• 2.3 結(jié)果與討論29-35
• 2.3.1 GO熒光淬滅能力分析29-30
• 2.3.2 M.SssI活性分析30-34
• 2.3.3 選擇性研究34
• 2.3.4 抑癌藥物的篩選34-35
• 2.4 結(jié)論35-37
• 第三章 GO熒光淬滅能力結(jié)合限制性內(nèi)切酶分析DNA去甲基酶活性37-45
• 3.1 引言37-38
• 3.2 實驗部分38-40
• 3.2.1 試劑38
• 3.2.2 GO的制備38
• 3.2.3 DNA去甲基酶活性分析38-39
• 3.2.4 MBD2選擇性分析39
• 3.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)和提取物的制備39-40
• 3.3 結(jié)果與討論40-44
• 3.3.1 GO熒光淬滅能力分析40
• 3.3.2 去甲基化條件優(yōu)化40-42
• 3.3.3 MBD2活性分析42-43
• 3.3.4 選擇性分析43-44
• 3.4 結(jié)論44-45
• 第四章 BGQDs的制備及在分析紅細(xì)胞中高鐵血紅素的應(yīng)用45-58
• 4.1 引言45-46
• 4.2 實驗部分46-49
• 4.2.1 BGQDs的制備46-47
• 4.2.2 儀器47
• 4.2.3 電化學(xué)檢測47
• 4.2.4 熒光檢測47-48
• 4.2.5 紅細(xì)胞溶出物的制備48
• 4.2.6 理論計算48-49
• 4.3 結(jié)果與討論49-57
• 4.3.1 BGQDs的表征及性質(zhì)研究49-53
• 4.3.2 BGQDs檢測高鐵血紅素53-54
• 4.3.3 選擇性分析54
• 4.3.4 高鐵血紅素對BGQDs熒光響應(yīng)機(jī)理研究54-56
• 4.3.5 實際檢測56-57
• 4.4 結(jié)論57-58
• 第五章 結(jié)論和展望58-60
• 5.1 結(jié)論58-59
• 5.2 展望59-60
• 參考文獻(xiàn)60-71
• 研究生期間的研究成果71-72
• 致謝72

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本文編號：702743