本文關(guān)鍵詞：田鼠巴貝蟲FTA-LAMP及基于BmSA1和SRA5抗原的診斷技術(shù)建立

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【摘要】：檢測技術(shù)是近年來巴貝蟲病防控、科研領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)、重點(diǎn),也是難點(diǎn)。這表現(xiàn)在病原形態(tài)檢測方法的容易漏檢、敏感性差,形態(tài)鑒定仍需受過專門培訓(xùn)的、業(yè)務(wù)熟練的專業(yè)技術(shù)人員才能完成,特別是蟲密度處于極低的狀態(tài)下,更易出現(xiàn)漏檢、假陰性。而免疫檢測技術(shù)多處于實(shí)驗(yàn)研究階段,已市場化的唯一免疫診斷技術(shù)是IFAT,由于判定結(jié)果需要熒光顯微鏡等,很難在現(xiàn)場和實(shí)際工作中使用。分子檢測技術(shù)也基本處于實(shí)驗(yàn)階段,多用于研究。而田鼠巴貝蟲感染的免疫、分子檢測、診斷方法,在我國更是處于實(shí)驗(yàn)初期起步階段,仍致力于診斷抗原的篩選、快速免疫及分了診斷技術(shù)研究。本課題應(yīng)用現(xiàn)代免疫學(xué)和分了生物學(xué)技術(shù)方法,通過診斷抗原篩選、克隆表達(dá),及單、多抗制備,優(yōu)化檢測系統(tǒng),以建立田鼠巴貝蟲感染的早期快速診斷技術(shù)方法。目的本文將通過分子生物學(xué)和免疫學(xué)及其技術(shù)方法研究,建立田鼠巴貝蟲感染的早期快速診斷技術(shù)方法。方法1)克隆表達(dá)田鼠巴貝蟲感染鼠血清反應(yīng)蛋白(SRA5),以純化的SRA5為診斷抗原建立檢測巴貝蟲循環(huán)抗體的ELISA方法和膠體金試紙條法,并評價(jià)其診斷效果。2)復(fù)蘇抗BmSAl單克隆抗體細(xì)胞株,大規(guī)模制備單抗,又純化的田鼠巴貝蟲BmSAl蛋自免疫新西蘭兔制備抗BmSAl多抗。篩選配對建立以單克隆抗體捕捉BmSAl抗原的雙抗體夾心ELISA方法和膠體金試紙條法,然后進(jìn)行診斷效果評價(jià)。3)根據(jù)GenBank公布的田鼠巴貝蟲基因序列,就細(xì)胞色素B基因保守序列區(qū)域設(shè)計(jì)了多套LAMP引物,利用LAMP RealTime TurbidimeterLA-320儀篩選最佳引物、反應(yīng)條件,建立LAMP檢測方法,從保存有血液樣本的FTA卡片中提取田鼠巴貝蟲DNA進(jìn)行LAMP,觀察檢測效果。結(jié)果1)經(jīng)生物信息學(xué)分析了解了田鼠巴貝蟲感染血清反應(yīng)相關(guān)蛋白5(SRA5)的分子結(jié)構(gòu),構(gòu)建了pET28a-SRA5表達(dá)載體,成功表達(dá)后獲得了純化的SRA5蛋白。以SRA5蛋白為診斷抗原,建立了SRA5-ELISA法,觀察其檢測田鼠巴貝蟲感染鼠血清抗體的效果顯示,于感染后的第4天陽性檢出率即達(dá)70%,之后其抗體監(jiān)出率均為100%,與瘧疾、弓形蟲病人血清無交叉反應(yīng)。2)以SRA5抗原制備了檢測循環(huán)抗體的膠體金免疫層析試紙條,用于檢測田鼠巴貝蟲感染鼠血清抗體。結(jié)果顯示,自第4天起感染田鼠巴貝蟲的小鼠血清即可檢出陽性,在感染早期染蟲率高于10%時(shí)即可以檢測到抗體,其與瘧疾、弓形蟲病人血清無交叉反應(yīng),特異性100%,具早期診斷價(jià)值。以5000份長征醫(yī)院PCR法篩選出來疑似巴貝蟲病人30份,膠體金試紙條法診斷出來陽性率83.3%。3)以抗BmSA1的2B12單抗,成功建立了檢測田鼠巴貝蟲循環(huán)抗原的雙抗體夾心ELISA方法,檢測重組BmSA1、田鼠巴貝蟲可溶性蟲體抗原,檢測靈敏度達(dá)0.1μg/ml。但檢測感染鼠血清效果差,似不宜用于田鼠巴貝蟲感染鼠血清循環(huán)抗原的檢測。4)以抗BmSA1單抗2B12研制成檢測特異性抗原的膠體金免疫層析試紙條法(IGCA),檢測田鼠巴貝蟲感染鼠血結(jié)果顯示,于感染4-9天可以檢測出來陽性結(jié)果即染蟲率高于10%時(shí)。但在此之前和之后可能由于其蟲密度較低而未能檢出。5)以重組BmSA1抗原作為抗體捕獲物制備了檢測田鼠巴貝蟲循環(huán)抗體的膠體金免疫層析試紙條。檢測田鼠巴貝蟲感染鼠血清及其它寄生蟲病人血清結(jié)果顯示,敏感性100%、特異性100%,與瘧疾、弓形蟲病病人血清無交叉反應(yīng),且于感染后的第7天所有感染鼠均為陽性,而部分小鼠于感染后第4天起血清檢測即出現(xiàn)陽性結(jié)果,具有早期診斷價(jià)值。6)建立了檢測田鼠巴貝蟲特異性細(xì)胞色素基因的FTA-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法。檢測感染鼠及其它寄生蟲病結(jié)果顯示,其檢測限量為0.687fg/μL、特異性100%,與瘧原蟲、弓形蟲等無交叉反應(yīng)；對感染1天的田鼠巴貝蟲小鼠血也可呈現(xiàn)陽性結(jié)果。表明,FTA-LAMP方法檢測田鼠巴貝蟲感染具有較好的敏感性和特異性,且具早期診斷價(jià)值。結(jié)論 首次克隆表達(dá)了田鼠巴貝蟲SRA5蛋白,制備了BmSA1單克隆抗體：成功建立了檢測田鼠巴貝蟲感染的FTA-LAMP方法：初步建立了基于BmSA1和SRA5抗原的檢測田鼠巴貝蟲循環(huán)抗原和/或循環(huán)抗體的夾心-ELISA法和免疫膠體金層析試紙條。FTA-LAMP法與SRA5-IGCA、BmSA1-1GCA其具有較好的敏感性和特異性,并具一定的早期診斷價(jià)值,具有較好的發(fā)展前景,但其診斷檢測效果有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和現(xiàn)場驗(yàn)證,而檢測循環(huán)抗原的雙抗體夾心-ELISA和IGCA法檢測效果不夠理想。
【關(guān)鍵詞】：田鼠巴貝蟲 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) BmSA1 SRA5 單克隆抗體 多抗 ELISA 膠體金試紙條
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R446.6;R53
【目錄】：

• 中英文全稱及縮寫對照5-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 前言11-17
• 技術(shù)路線17-18
• 第一部分 田鼠巴貝蟲感染鼠血清反應(yīng)蛋白SRA5的重組表達(dá)及診斷效果評價(jià)18-29
• 引言18
• 1 材料與方法18-23
• 2 結(jié)果23-28
• 3 討論28-29
• 第二部分 BmSA1單克隆抗體捕捉抗原的ELISA方法的建立29-48
• 引言29
• 1 材料和方法29-40
• 2 結(jié)果40-47
• 3 討論47-48
• 第三部分 檢測田鼠巴貝蟲感染的膠體金免疫層析試紙條的研制48-55
• 引言48
• 1 材料與方法48-50
• 2 結(jié)果50-53
• 3 討論53-55
• 第四部分 田鼠巴貝蟲感染FTA-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)的建立55-70
• 引言55
• 1 材料與方法55-61
• 2 結(jié)果61-68
• 3 討論68-70
• 全文總結(jié)70-71
• 參考文獻(xiàn)71-76
• 致謝76-77
• 綜述 己貝蟲感染的免疫77-85
• 參考文獻(xiàn)82-85
• 附錄185-86
• 附件86-97

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本文編號：702714