本文關(guān)鍵詞：三種病毒RPA檢測方法的建立及陽性對照品的制備

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【摘要】：蜱傳腦炎病毒(Tick-borne encephalitis virus,TBEV),是一種以蜱為傳播媒介的蟲媒病毒,隸屬于黃病毒科黃病毒屬,共分為三個亞型,東歐亞型、西伯利亞亞型、遠東亞型[1]。蜱傳腦炎病毒的暴露極易導(dǎo)致蜱傳腦炎的發(fā)生,蜱傳腦炎是一種累及中樞系統(tǒng)的病毒感染性疾病。10%-20%的病毒感染患者會出現(xiàn)長時性或永久性神經(jīng)系統(tǒng)損傷,預(yù)后不好。近年來,我國北部林區(qū)的病例報告數(shù)目持續(xù)增加[2]。埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)是引起人類及其他哺乳動物致死性埃博拉出血熱的病原體。埃博拉病毒隸屬于絲狀病毒科,埃博拉病毒屬,分為五個亞型,分別為:扎伊爾型,蘇丹型,科特迪瓦型,雷斯頓型和本地布焦型[3]。其中扎伊爾型及蘇丹型對人類和非人靈長類動物的致病性和致死率很高。同時,引起此次2013-2015西非埃博拉出血熱大暴發(fā)的也正是扎伊爾型埃博拉出血熱,最終導(dǎo)致至少28638名疑似病例,11315病例確認死亡。因目前尚無特效的疫苗及治療藥物,世界衛(wèi)生組織將其列為生物安全4級病原微生物[3,4]。中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-Co V),也被稱為駱駝流感,是由中東呼吸綜合征冠狀病毒引起的病毒性感染性呼吸道綜合征。發(fā)病癥狀嚴重程度從中度到重度不等,主要臨床癥狀有發(fā)熱,咳嗽,腹瀉,氣短等。疾病在免疫力低下及患有其他疾病的病人身上更為嚴重。目前,沒有針對于此疾病的特效疫苗和治療藥物。截止2015年5月,已報道1000名病例,他們中的40%已經(jīng)死亡。中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-Co V),是β冠狀病毒屬的新成員,2012年第一次被報道,而就在2015年6月,全世界21個城市都出現(xiàn)了報告病例[5],其中包括英國、美國、韓國和我國的澳門,在一定程度上引起了大家的關(guān)注和恐慌。因此,病毒感染性疾病的早期診斷與及時治療對患者的康復(fù)及預(yù)后都起著至關(guān)重要的作用。而病毒的檢測則是疾病確切診斷的前提條件。目前,病毒感染的實驗室及臨床診斷檢測方法主要有病毒細胞內(nèi)培養(yǎng)、特異抗原抗體檢測[6]、紅細胞凝集反應(yīng)和病毒核酸檢測等等。近年來,隨著聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的發(fā)展,核酸快速檢測技術(shù)日臻完善[7-9]。實時定量聚合酶鏈反應(yīng)是建立在聚合酶鏈技術(shù)基礎(chǔ)上的一項分子生物學(xué)實驗技術(shù)。它可以實現(xiàn)DNA模板擴增過程的全程可視化,而不是像傳統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)一樣,只能在反應(yīng)結(jié)束后才可觀察到結(jié)果。同時,實時定量聚合酶鏈反應(yīng)可以實現(xiàn)對DNA模板濃度的定量。通�？梢酝ㄟ^兩個方法來實現(xiàn):一種是在反應(yīng)體系中加入與任一雙鏈DNA都可以結(jié)合的非特異性熒光染料;另一種是設(shè)計標記有發(fā)光基團并可以與檢測核酸特異性結(jié)果的探針,只在檢測核酸存在的情況下與之結(jié)合。在病毒的核酸檢測中,我們可以通過設(shè)計待檢病毒的特異性引物、探針,實現(xiàn)病毒的快速檢測及定量分析[10,11]。然而,病毒感染性疾病通常暴發(fā)于條件比較艱苦,缺乏實驗室環(huán)境的偏遠地區(qū),這些地區(qū)一般無法提供實時定量聚合酶鏈反應(yīng)所必須的儀器設(shè)備和試劑,這也體現(xiàn)出了實時定量聚合酶鏈反應(yīng)的局限性。因此,我們試圖尋找一種可以用于現(xiàn)場及非實驗室環(huán)境下的快速核酸檢測技術(shù),以期它可以在現(xiàn)場及偏遠地區(qū)進行病毒核酸快速檢測。重組聚合酶擴增技術(shù)(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)是一種新型等溫核酸擴增技術(shù)[12-14]。在37-42℃條件下,10-15min能夠完成核酸的擴增。在這種新型的等溫核酸擴增體系中,重組酶體系幫助單鏈引物與DNA雙鏈模板中的互補序列結(jié)合,啟動核酸擴增過程,無需解鏈、退火過程,因此實現(xiàn)核酸的等溫擴增。同時,通過T4噬菌體uvs X蛋白與ATP的結(jié)合與釋放,建立動態(tài)反應(yīng)環(huán)境,來平衡單鏈引物復(fù)合體與新合成核酸,達到整個反應(yīng)的持續(xù)指數(shù)擴增。經(jīng)探索,發(fā)現(xiàn)在體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶可以實現(xiàn)一步法RNA擴增,利于RNA病毒核酸擴增。核酸擴增完成后,我們可以通過瓊脂糖凝膠電泳的方式觀察結(jié)果,也可以通過向反應(yīng)體系加入一條特異性熒光探針的方法,來實現(xiàn)實時觀察。因此我們可以通過檢測樣品中目的核酸片段,來進行相應(yīng)的病毒檢測。由于是等溫擴增技術(shù),因此免去了聚合酶鏈技術(shù)中循環(huán)變溫加熱器等大型設(shè)備的使用。這些優(yōu)點使得利用重組聚合酶擴增技術(shù)建立快速、低耗的現(xiàn)場病毒核酸檢測技術(shù)成為可能。RPA技術(shù)在2006年由劍橋大學(xué)的Olaf Piepenburg、Colin H.Williams、Derek L.Stemple等人建立,僅有約10年的發(fā)展歷史,是一項較新的等溫核酸擴增技術(shù),該技術(shù)很好地解決了在缺少大型溫度調(diào)節(jié)設(shè)備或者現(xiàn)場環(huán)境下無法進行核酸擴增及后續(xù)分析的難題。僅需利用一臺1kg的熒光檢測儀配備筆記本電腦即可實現(xiàn)核酸擴增的實時觀察或利用37-42℃恒溫箱配備膠體金試紙條實現(xiàn)病毒檢測。裝甲RNA病毒樣顆粒(armored RNA virus-like particle)技術(shù)是一種RNA陽性對照品制備技術(shù)。利用該技術(shù)制備出的陽性對照品中含有檢測目的片段的RNA序列,相比于滅活病毒更安全,相比于質(zhì)粒對照品更能準確反映檢測體系。它的原理是利用基因工程方法將大腸桿菌MS2噬菌體外殼蛋白基因序列、檢測目的片段基因序列克隆到表達載體上。載體通過逆轉(zhuǎn)錄將目的片段逆轉(zhuǎn)錄為RNA,同時表達出MS2外殼蛋白,將逆轉(zhuǎn)錄的RNA包裹裝配成球形病毒樣顆粒。這樣的病毒樣顆粒保護了其內(nèi)部的RNA免受RNase的破壞[9,15-19]。本研究利用RPA技術(shù)建立蜱傳腦炎病毒,扎伊爾型埃博拉病毒,中東呼吸綜合征冠狀病毒三種RNA病毒核酸快速檢測方法,并通過與實時定量PCR相比較的方式驗證了所建立檢測方法的靈敏度和特異性。第一,在蜱傳腦炎病毒RPA檢測方法的建立中,針對于病毒序列3’非編碼區(qū)保守序列進行引物、探針設(shè)計;建立了兩步法RT-RPA檢測方法;利用三種逆轉(zhuǎn)錄酶建立了兩步法RT-q RPA檢測方法并進行了檢測體系的優(yōu)化;利用五種逆轉(zhuǎn)錄酶建立一步法RT-q RPA檢測方法并進行了檢測體系的優(yōu)化;并利用活病毒及本研究中制備的陽性對照品對所建立的檢測方法進行了靈敏性驗證,同時利用黃病毒屬其他病毒的RNA對檢測方法的特異性進行了驗證;最后,利用本研究中建立的一步法RT-q RPA檢測方法對54份蜱傳腦炎疑似臨床樣本進行了檢測,同時利用RT-q PCR檢測方法檢測了此批樣本,對兩者檢測結(jié)果進行比較。第二,在扎伊爾型埃博拉病毒RPA檢測方法的建立中,針對于病毒序列NP蛋白保守序列設(shè)計引物、探針;建立了兩步法RT-q RPA檢測方法;利用陽性質(zhì)粒驗證檢測體系靈敏度;利用出血熱癥候群病毒RNA對檢測體系進行了特異性驗證。第三,在中東呼吸綜合征冠狀病毒RPA檢測方法的建立中,分別針對于病毒序列開放閱讀框5與E蛋白之間的序列(up E)及N蛋白序列的保守區(qū)域設(shè)計了兩對引物、探針對;利用兩種逆轉(zhuǎn)錄酶建立一步法RT-q RPA檢測方法;制備了針對于兩個不同檢測目的片段的兩個陽性對照品;并利用該陽性對照品對檢測方法的靈敏度進行了驗證;利用其它病毒RNA及SARS冠狀病毒陽性質(zhì)粒及本研究中建立的陽性對照品驗證該檢測方法的特異性。建立的兩步法TBEV RT-q RPA檢測體系靈敏度可達10-2TCID50;一步法TBEV RT-q RPA檢測體系靈敏度可達10-2TCID50,1.8拷貝/體系;54份蜱傳腦炎臨床疑似樣本檢測結(jié)果顯示與現(xiàn)行RT-q PCR檢測方法檢測結(jié)果相比較,沒有統(tǒng)計學(xué)差異,表明檢測體系可靠。建立的兩步法ZEBOV RT-q RPA檢測體系靈敏度可達100拷貝/體系。一步法MERS-Co V-up E RT-q RPA檢測體系靈敏度可達4拷貝/體系;一步法MERS-Co V-up E RT-q RPA檢測體系靈敏度可達1拷貝/體系。同時檢測結(jié)果顯示,所建立的檢測體系特異性好,不發(fā)生交叉反應(yīng)。本研究中,所制備的裝甲RNA病毒樣顆粒陽性對照品在電鏡下可見直徑25nm左右的球形顆粒。本研究建立了針對蜱傳腦炎病毒的RPA快速核酸檢測技術(shù),經(jīng)驗證所建立的檢測體系可以檢測到濃度為10-2TCID50的活病毒,同時可以檢測到單拷貝的含目的片段的陽性對照品,較針對于同一目的片段的RT-q PCR檢測方法靈敏度高(10-2TCID50,380拷貝/體系)。此外,針對扎伊爾型埃博拉病毒、中東呼吸綜合征冠狀病毒,同樣建立了RPA核酸等溫擴增檢測技術(shù),分別可以檢測到100拷貝、單拷貝的相應(yīng)目的片段,其中MERS-Co V-up E RT-q RPA檢測方法較針對于同一目的片段的RT-q PCR檢測方法靈敏度高(RT-q PCR靈敏度為38拷貝/體系),其余幾種與RT-q PCR靈敏度相同。本研究建立的所有的檢測體系的特異性好,不與其他病毒核酸發(fā)生交叉反應(yīng)。有望用于偏遠地區(qū)及現(xiàn)場快速核酸檢測。
【關(guān)鍵詞】：重組聚合酶擴增技術(shù) RNA檢測技術(shù) 裝甲RNA病毒樣
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R512.3;R440
【目錄】：

• 縮略詞表4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 前言12-17
• 第一部分 蜱傳腦炎病毒RPA檢測方法的建立及陽性對照品的制備17-46
• 1 材料與儀器設(shè)備17-19
• 2 方法19-34
• 3 結(jié)果34-44
• 4 討論44-46
• 第二部分 扎伊爾型埃博拉病毒RPA檢測方法的建立46-53
• 1 材料與儀器設(shè)備46
• 2 方法46-49
• 3 結(jié)果49-51
• 4 討論51-53
• 第三部分 中東呼吸綜合征冠狀病毒RPA檢測方法的建立及陽性對照品的制備53-66
• 1 材料與儀器設(shè)備53
• 2 方法53-57
• 3 結(jié)果57-64
• 4 討論64-66
• 結(jié)論66-67
• 參考文獻67-72
• 碩士期間撰寫的論文72-73
• 個人簡歷73-74
• 致謝74

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本文編號：635417