本文關鍵詞：萬古霉素耐藥腸球菌的分子特征及腸球菌感染小鼠代謝組學分析

  更多相關文章： 腸球菌 萬古霉素耐藥 基因型 膿毒癥 非靶向代謝組學 靶向代謝組學 LC-MS/MS 生物標志物

【摘要】：目的 對實驗室保存的325株腸球菌進行萬古霉素非敏感菌篩選,并對篩選出的菌株進行耐藥表型、耐藥基因型、菌株同源性分析；建立糞腸球菌ATCC 29212和ATCC 51299感染Balb/c小鼠膿毒癥模型；建立基于液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)非靶向與靶向代謝組學相結(jié)合的分析方法,開展腸球菌感染小鼠膿毒癥代謝組學分析,尋找疾病狀態(tài)下生物標志物,分析小鼠感染過程中可能影響的代謝通路。方法采用瓊脂平皿二倍稀釋法或肉湯微稀釋法篩選萬古霉素非敏感菌,并檢測菌株對替考拉寧的敏感性；采用PCR方法檢測萬古霉素非敏感腸球菌的耐藥基因型；通過腸道細菌基因間重復一致序列(ERIC) PCR技術(shù)、脈沖場凝膠電泳(PFGE)技術(shù)、多位點序列分型(MLST)技術(shù)進行菌株的同源性分析。建立糞腸球菌ATCC 29212和ATCC 51299腹腔感染小鼠膿毒癥模型,通過血培養(yǎng)確證模型的成功,在小鼠感染前后進行白細胞計數(shù),通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定降鈣素原(PCT)、C反應蛋白(CRP)含量,監(jiān)測小鼠膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中狀態(tài)的變化。建立基于液相質(zhì)譜(LC-MS)技術(shù)的血漿非靶向代謝組學分析方法,應用于糞腸球菌ATCC 29212感染小鼠后4h、8h、24h的血漿樣本分析,建立多元統(tǒng)計模型,通過S-plot圖,VIP list, Jack-knifed置信區(qū)間圖,獨立樣本t-test篩選差異性代謝物,對得到的差異性代謝物進行代謝物富集分析和代謝途徑分析,獲取小鼠膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中可能相關的代謝通路。以非靶向代謝組學發(fā)現(xiàn)的差異性代謝物和文獻中報導的部分生物標志物為對象,建立基于LC-MS/MS技術(shù)的靶向代謝組學分析方法,對方法的精密度和靈敏度進行考察,并應用于腸球菌ATCC 29212和ATCC 51299感染小鼠靶向代謝組學分析,結(jié)合獨立樣本t檢驗,篩選潛在生物標志物。結(jié)果從325株臨床分離腸球菌中共篩選出17株萬古霉素非敏感菌,包括1株糞腸球菌、11株屎腸球菌和5株鶉雞腸球菌。其中1株糞腸球菌和11株屎腸球菌對萬古霉素高水平耐藥,對替考拉寧耐藥或中介耐藥,PCR檢測結(jié)果顯示vanA型：5株鶉雞腸球菌對萬古霉素中介耐藥,對替考拉寧敏感,PCR檢測結(jié)果顯示vanC1型。ERIC同源性分析顯示同基因型的大多數(shù)菌株顯示相似的ERIC分型；PFGE同源性分析顯示,17株臨床萬古霉素非敏感腸球菌分型不同,不屬于單克隆流行播散；MLST同源性分析顯示,1株臨床萬古霉素非敏感糞腸球菌屬于ST4,11株臨床萬古霉素非敏感屎腸球菌共分為6個ST型,其中4株屬于ST78,是屎腸球菌出現(xiàn)頻率最高的ST型。在腸球菌感染小鼠非靶向代謝組學分析中,成功建立了腸球菌感染小鼠膿毒癥模型,采用基于LC-MS技術(shù)的非靶向代謝組學分析,對空白對照組與感染后4h、8h、24h組小鼠進行兩兩比對分析,在ESI正離子檢測模式下分別得到了69種、69種、61種差異性代謝物,在負離子檢測模式下分別得到了99種、91種、90種差異性代謝物,綜合兩兩比對結(jié)果,最終得到了95種差異性代謝物,其中21種差異性代謝物在整個感染過程中均有顯著的變化。代謝物富集分析和代謝通路分析結(jié)果推測膿毒癥影響氨基酸代謝、磷脂代謝、三羧酸循環(huán)、亞油酸和亞麻酸代謝、尿素循環(huán)。以40種差異性代謝物為對象,建立靶向代謝組學分析方法,針對糞腸球菌ATCC 29212和ATCC 51299感染小鼠膿毒癥模型進行分析,最終在糞腸球菌ATCC 29212感染小鼠膿毒癥模型中篩選出17種潛在生物標志物,在糞腸球菌ATCC 51299感染小鼠膿毒癥模型中篩選出12種潛在生物標志物。結(jié)論我國萬古霉素耐藥菌在糞腸球菌中分離率較低,但屎腸球菌中萬古霉素耐藥情況較嚴重,并且耐藥菌株攜帶易于傳播和轉(zhuǎn)移的vanA基因。同源性分析結(jié)果顯示萬古霉素耐藥存在同源性傳播的可能性；在糞腸球菌ATCC 29212感染小鼠膿毒癥模型中發(fā)現(xiàn)的17種潛在生物標志物中,感染動物體內(nèi)�；撬�、胸苷、胞苷、肌酸、谷氨酰胺、2-甲基蘋果酸、核黃素、檸檬酸8種代謝物含量上升,而PE(P-16：0/0：0)、肌苷、可的松、馬尿酸、吲哚、色氨酸、龍膽酸、蛋氨酸、丙酮酸9種代謝物含量下降：在糞腸球菌ATCC 51299感染小鼠膿毒癥模型中發(fā)現(xiàn)的12種潛在生物標志物中,PE(P-16：0/0：0)、色氨酸、丙酮酸、吲哚、可的松、龍膽酸、瓜氨酸、馬尿酸、桂皮酸9種代謝物含量下降,胞苷、胸苷、組氨酸3種代謝物含量上升。兩株菌感染小鼠膿毒癥模型中9個潛在生物標志物相同,具有相似的結(jié)果。通過生物標志物之間的相關性和代謝途徑考察,分析推斷腸球菌感染小鼠膿毒癥模型影響氨基酸代謝、磷脂代謝及能量代謝過程。
【關鍵詞】：腸球菌 萬古霉素耐藥 基因型 膿毒癥 非靶向代謝組學 靶向代謝組學 LC-MS/MS 生物標志物
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R446.5
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 縮略語表9-11
• 前言11-16
• 第一部分 萬古霉素耐藥腸球菌的篩選和基因型分析16-33
• 1 實驗材料16-19
• 2 實驗方法19-26
• 3 結(jié)果26-30
• 4 討論30-32
• 5 小結(jié)32-33
• 第二部分 腸球菌感染小鼠膿毒癥非靶向代謝組學分析33-52
• 1 實驗材料33-34
• 2 實驗方法34-37
• 3 結(jié)果37-49
• 4 討論49-51
• 5 小結(jié)51-52
• 第三部分 腸球菌感染小鼠靶向代謝組學分析52-74
• 1 實驗材料52-53
• 2 實驗方法53-56
• 3 結(jié)果56-72
• 4 討論72-73
• 5 小結(jié)73-74
• 參考文獻74-80
• 文獻綜述80-89
• 參考文獻86-89
• 個人簡歷及在校期間發(fā)表的學術(shù)文章89-90
• 致謝90-91

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本文編號：511908