本文關(guān)鍵詞：野生型小鼠膿毒血癥模型的建立及應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:膿毒血癥及其引發(fā)的膿毒癥休克和多器官衰竭是臨床醫(yī)生和研究者共同關(guān)注的問(wèn)題,目前普遍認(rèn)為膿毒血癥病理機(jī)理的根本原因是機(jī)體炎癥反應(yīng)和抗炎反應(yīng)失衡。腺苷A2A受體可介導(dǎo)抑制免疫反應(yīng)的信號(hào),減輕組織損傷,已有研究報(bào)道,腺苷A2A受體拮抗劑能有效提高膿毒血癥小鼠生存率。在炎癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,內(nèi)皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞都參與疾病過(guò)程,A2A受體拮抗劑對(duì)膿毒血癥的調(diào)節(jié)作用是否與內(nèi)皮細(xì)胞的功能有關(guān)還未見(jiàn)報(bào)道。因此,本課題將利用內(nèi)皮細(xì)胞腺苷A2A受體特異性敲除小鼠,采用盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)(CecalLigation and Puncture,CLP)建立小鼠膿毒血癥模型,并與A2A受體拮抗劑的治療作用進(jìn)行比較,探討A2A受體拮抗劑對(duì)膿毒血癥的調(diào)控作用與內(nèi)皮細(xì)胞功能的相關(guān)性。方法:1.小鼠膿毒血癥模型建立。選取9~12W的C57BL/6J雄性小鼠,通過(guò)結(jié)扎盲腸50%和75%后穿孔手術(shù),建立膿毒血癥模型。模型建立后,統(tǒng)計(jì)小鼠生存率;細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)血液和腹腔液載菌量的變化;血常規(guī)儀檢測(cè)白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板數(shù)目變化;血生化儀檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血清尿素氮(BUN)水平;Luminex儀檢測(cè)細(xì)胞因子GM-CSF、INF-γ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2表達(dá);ELISA檢測(cè)內(nèi)皮功能紊亂分子血栓調(diào)節(jié)蛋白(Thrombomodulin,TM)、E-選擇素(E-selection)、血管細(xì)胞間黏附分子-1(VCAM-1)、可溶性細(xì)胞黏附因子-1(sICAM-1)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vegf)及其受體vegfr-1;he染色檢測(cè)clp術(shù)后小鼠肺、肝、腎組織血栓形成及其它病理變化。2.腺苷a2a受體拮抗對(duì)膿毒血癥的治療作用。根據(jù)c57bl/6j野生型小鼠術(shù)后變化指標(biāo),利用內(nèi)皮細(xì)胞上腺苷a2a受體特異性敲除小鼠(a2afloxp/floxpcdh5cre/+)和背景對(duì)照小鼠(a2afloxp/floxp)進(jìn)行clp實(shí)驗(yàn),同時(shí)對(duì)a2afloxp/floxp小鼠術(shù)后給予腺苷a2a受體抑制劑kw6002(10mg/kg,s.c.)和溶劑,進(jìn)行a2a受體拮抗劑對(duì)小鼠膿毒血癥治療機(jī)制的研究。術(shù)后統(tǒng)計(jì)小鼠生存率;檢測(cè)血液和腹腔液16h和48h載菌量變化;血常規(guī)和血液生化指標(biāo);細(xì)胞因子il-1α、il-1β、il-2、il-4、il-6、il-10、il-12、il-15、il-17和趨化因子mip-1α、mip-1β、mip-2水平;內(nèi)皮功能紊亂標(biāo)志物tm、e-selection、vcam-1、sicam-1、vegf、vegfr-1的變化;肺、肝、腎組織病理檢測(cè)血栓形成等病理變化;綜合以上數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)腺苷a2a受體抑制對(duì)膿毒血癥的治療作用與小鼠內(nèi)皮細(xì)胞腺苷a2a受體敲除的相關(guān)性。結(jié)果:1.c57bl/6j小鼠膿毒血癥模型建立小鼠進(jìn)行clp手術(shù),其生存率與盲腸結(jié)扎位點(diǎn)相關(guān),結(jié)扎小鼠盲腸75%術(shù)后4天小鼠全部死亡,結(jié)扎小鼠盲腸50%術(shù)后12天生存率約為40%;采用50%結(jié)扎手術(shù),與假手術(shù)組比,臨床血液指標(biāo)檢測(cè)顯示,術(shù)后16h和48h與假手術(shù)組相比白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞明顯下降;血生化指標(biāo)顯示谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast),血清尿素氮(bun)明顯升高;細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示,促炎因子il-1α、il-6、tnf-α和抗炎因子il-10以及趨化因子mip-1α、mip-1β、mip-2明顯上升,其它因子未見(jiàn)明顯變化;內(nèi)皮功能紊亂標(biāo)志物檢測(cè)顯示sicam-1、e-slectin、vegf、vegfr1和tm呈上升趨勢(shì),vcam-1未見(jiàn)明顯變化。組織病理檢測(cè)可見(jiàn)clp術(shù)后小鼠肺組織間質(zhì)充血,有彌散性血管內(nèi)凝血(dic)和血栓形成,肝臟和腎臟也出現(xiàn)充血和血栓,但沒(méi)有肺臟病變明顯。2.腺苷a2a受體拮抗對(duì)膿毒血癥治療作用a2afloxp/floxpcdh5cre/+小鼠是血管內(nèi)皮腺苷受體條件性敲除小鼠,在生理正常條件下不影響滲透功能,在clp疾病狀況下,給予evansblue顯示肝、腎、肺組織的滲透下降。利用a2afloxp/floxpcdh5cre/+小鼠和a2afloxp/floxp小鼠進(jìn)行clp實(shí)驗(yàn),同時(shí)對(duì)a2afloxp/floxp小鼠術(shù)后皮下給予腺苷受體抑制劑kw6002(10mg/kg)和溶劑。結(jié)果顯示:(1)小鼠死亡率:a2afloxp/floxp小鼠12天死亡率95%,a2afloxp/floxpcdh5cre/+小鼠12天死亡率55%,血管內(nèi)皮腺苷受體a2a敲除小鼠進(jìn)行clp實(shí)驗(yàn)明顯比對(duì)照小鼠的死亡率降低。a2afloxp/floxp小鼠溶劑組小鼠死亡率85%,給抑制劑組為38%,a2a抑制劑給予clp術(shù)后小鼠與對(duì)照組相比,明顯降低死亡率。(2)血液中載菌量檢測(cè):a2afloxp/floxpcdh5cre/+小鼠術(shù)后16h,比a2afloxp/floxp小鼠明顯下降,術(shù)后48h也顯示相似的下降趨勢(shì);a2afloxp/floxp小鼠術(shù)后給予抑制劑組術(shù)后16h的載菌量比溶劑組顯示下降趨勢(shì),術(shù)后48h也顯示相似的下降趨勢(shì)。腹腔載菌量檢測(cè),a2afloxp/floxpcdh5cre/+小鼠術(shù)后16h,比a2afloxp/floxp小鼠明顯下降,術(shù)后48h也顯示相似的下降趨勢(shì);a2afloxp/floxp小鼠術(shù)后給予抑制劑組術(shù)后16h的載菌量比溶劑組顯示下降趨勢(shì),術(shù)后48h也顯示相似的下降趨勢(shì)。(3)血常規(guī)檢測(cè):a2afloxp/floxpcdh5cre/+小鼠和a2afloxp/floxp小鼠比較,術(shù)后16h、48h白細(xì)胞數(shù)未見(jiàn)明顯變化;白細(xì)胞分類中中性粒細(xì)胞數(shù)在術(shù)后16h出現(xiàn)下降趨勢(shì),其它單核細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)上都未見(jiàn)明顯變化。a2afloxp/floxp小鼠術(shù)后給予抑制劑組與溶劑組比較,術(shù)后16h、48h白細(xì)胞數(shù)未見(jiàn)明顯變化;白細(xì)胞分類中中性粒細(xì)胞數(shù)在術(shù)后16h出現(xiàn)下降趨勢(shì),單核細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)上都未見(jiàn)明顯變化。(4)血生化指標(biāo)檢測(cè):a2afloxp/floxpcdh5cre/+小鼠和a2afloxp/floxp小鼠比較,術(shù)后16h,48h肝轉(zhuǎn)氨酶ast和尿素氮bun出現(xiàn)下降趨勢(shì),谷丙轉(zhuǎn)氨酶alt未見(jiàn)明顯變化趨勢(shì),但是a2afloxp/floxp小鼠術(shù)后給予抑制劑與溶劑比較,術(shù)后16h,48halt,ast,bun未見(jiàn)明顯變化趨勢(shì)。(5)細(xì)胞因子檢測(cè):a2afloxp/floxpcdh5cre/+小鼠和a2afloxp/floxp小鼠比較,術(shù)后16h,炎癥因子il1α、il10、il6、mip1β、mip2明顯下降,其它因子mip1α、tnfα水平無(wú)明顯變化;術(shù)后48h檢測(cè)的炎癥因子,未見(jiàn)明顯變化。a2afloxp/floxp小鼠術(shù)后給予抑制劑組與溶劑組比較,術(shù)后16h,il1α、il10、il6、mip1β、mip2明顯下降,其它因子mip1α、tnfα水平無(wú)明顯變化;術(shù)后48h檢測(cè)的炎癥因子,未見(jiàn)明顯變化。(6)內(nèi)皮功能相關(guān)標(biāo)志物檢測(cè):a2afloxp/floxpcdh5cre/+小鼠和a2afloxp/floxp小鼠比較,術(shù)后16h,tm、tf呈下降趨勢(shì),vegf未見(jiàn)明顯變化;術(shù)后48h,tm維持下降趨勢(shì),vegf出現(xiàn)下降趨勢(shì),tf未見(jiàn)明顯變化。a2afloxp/floxp小鼠術(shù)后給予抑制劑組與溶劑組比較,術(shù)后16h,tm、tf、vegf出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì),術(shù)后48h,tm維持下降趨勢(shì),TF、VEGF未見(jiàn)明顯變化。(7)組織病理檢測(cè):術(shù)后16hA2Afloxp/floxp小鼠肺臟充血,有較大血栓形成在血管內(nèi),A2Afloxp/floxp cdh5cre/+小鼠肺組織間隔可見(jiàn)血栓形成,抑制劑組較溶劑組充血和血栓情況減輕。48h各組小鼠肺組織血管內(nèi)和肺間隔均可見(jiàn)較為嚴(yán)重的血栓形成;肝組織16h病理檢測(cè)可見(jiàn),A2Afloxp/floxp小鼠和A2Afloxp/floxp cdh5cre/+小鼠以及溶劑組和伊曲茶堿組肝臟血管內(nèi)均偶爾可見(jiàn)充血和血栓形成。腎組織病理檢測(cè)各組小鼠基本正常,A2Afloxp/floxp組和溶劑組小鼠出現(xiàn)腎組織內(nèi)充血及血栓形成,A2Afloxp/floxp cdh5cre/+小鼠以及伊曲茶堿組腎臟較少充血和血栓形成。結(jié)論:1.C57野生型小鼠CLP手術(shù)后形成膿毒血癥特征,血液出現(xiàn)大量細(xì)菌,損傷肝、腎功能,IL-6等促炎因子和趨化因子升高,內(nèi)皮功能相關(guān)標(biāo)志物TM、VEGF發(fā)生變化。2.腺苷A2A受體抑制劑能改善小鼠膿毒血癥的生存,降低血液中細(xì)菌量,抑制IL6、IL1α、IL10、MIP1α、MIP1β、MIP2升高,降低VEGF、TM和E-slectin和TF水平。3.血管內(nèi)皮腺苷A2A受體敲除小鼠進(jìn)行CLP實(shí)驗(yàn),也能改善小鼠膿毒血癥的生存,降低血液細(xì)菌載量,保護(hù)肝腎功能,抑制IL6、MIP2的升高,降低TM、E-slectin、VEGFR1和TF水平。4.腺苷A2A受體抑制劑對(duì)小鼠膿毒血癥有治療作用,這種治療作用與內(nèi)皮的腺苷受體抑制具有緊密的相關(guān)性。
【關(guān)鍵詞】：膿毒血癥 盲腸結(jié)扎穿刺模型 腺苷A2A受體 腺苷受體抑制劑 血管內(nèi)皮腺苷A2A受體敲除小鼠
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R-332;R459.7
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• ABSTRACT9-13
• 序言13-20
• 1 研究背景13-19
• 2 研究意義19-20
• 實(shí)驗(yàn)部分20-23
• 實(shí)驗(yàn)材料20-23
• 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物20
• 2 主要試劑耗材20-21
• 3 主要實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備21-22
• 4 常用試劑配制22-23
• 第一部分 野生型小鼠膿毒血癥模型建立及評(píng)價(jià)23-36
• 1 實(shí)驗(yàn)方法23-27
• 1.1 建立模型23
• 1.2 模型指標(biāo)檢測(cè)23-26
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析26-27
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-36
• 2.1 小鼠CLP手術(shù)和術(shù)后生存27-28
• 2.2 小鼠CLP術(shù)后載菌量情況28-29
• 2.3 小鼠CLP術(shù)后血常規(guī)和血生化指標(biāo)檢測(cè)29-30
• 2.4 小鼠CLP術(shù)后細(xì)胞因子水平檢測(cè)30-32
• 2.5 小鼠CLP術(shù)后內(nèi)皮紊亂因子水平檢測(cè)32-34
• 2.6 小鼠CLP術(shù)后組織病理檢測(cè)34-36
• 第二部分 拮抗腺苷A2A受體對(duì)膿毒血癥小鼠保護(hù)作用的研究36-52
• 1 實(shí)驗(yàn)方法36-39
• 1.1 轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定36-37
• 1.2 A2A條件性敲除小鼠膿毒血癥模型制備37
• 1.3 給藥試驗(yàn)37
• 1.4 A2A小鼠CLP術(shù)后載菌量檢測(cè)37-38
• 1.5 A2A小鼠CLP術(shù)后血常規(guī)和血生化檢測(cè)38
• 1.6 A2A小鼠CLP術(shù)后細(xì)胞因子檢測(cè)38
• 1.7 A2A小鼠CLP術(shù)后Evans blue染色檢測(cè)血管通透性38
• 1.8 A2A小鼠CLP術(shù)后內(nèi)皮紊亂因子檢測(cè)38
• 1.9 A2A小鼠CLP術(shù)后組織病理檢測(cè)38-39
• 1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析39
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-52
• 2.1 A2A floxp/floxp和Cdh5的基因鑒定39-40
• 2.2 CLP術(shù)后A2A小鼠生存狀況40-41
• 2.3 CLP術(shù)后A2A小鼠載菌量變化41
• 2.4 CLP術(shù)后A2A小鼠血液常規(guī)和生化指標(biāo)41-43
• 2.5 CLP術(shù)后A2A小鼠細(xì)胞因子水平43-45
• 2.6 CLP術(shù)后A2A小鼠血管通透性45
• 2.7 CLP術(shù)后A2A小鼠內(nèi)皮紊亂分子指標(biāo)45-48
• 2.8 CLP術(shù)后A2A小鼠組織病理48-52
• 討論52-55
• 參考文獻(xiàn)55-60
• 附件60-67
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文67-68
• 附錄 縮寫(xiě)詞中英文對(duì)照表68-69
• 致謝69

【相似文獻(xiàn)】

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1 蔣夢(mèng)筆;閔蘇;羅潔;林菁艷;李煒;劉力;;膿毒血癥模型大鼠單次大劑量應(yīng)用甲潑尼龍對(duì)羅庫(kù)溴銨肌松效應(yīng)的影響研究[J];中國(guó)藥房;2011年25期

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1 荊喜中;野生型小鼠膿毒血癥模型的建立及應(yīng)用研究[D];廣東藥科大學(xué);2016年

  本文關(guān)鍵詞：野生型小鼠膿毒血癥模型的建立及應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：440770