本文關(guān)鍵詞：DNA等溫?cái)U(kuò)增檢測副溶血性弧菌的新技術(shù)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近年來,新發(fā)展起來的核酸擴(kuò)增技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)及其相關(guān)的各個(gè)領(lǐng)域,對生命科學(xué)的發(fā)展發(fā)揮著重要的作用。由于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)需要反復(fù)的熱變性,依賴于特定的熱循環(huán)儀,從而使其應(yīng)用范圍受到了一定的限制。因此,建立簡便快速、靈敏、準(zhǔn)確的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)對核酸的體外擴(kuò)增檢測具有非常重要的意義,并在臨床和現(xiàn)場快速診斷中具有良好的應(yīng)用前景。本論文構(gòu)建了兩種簡單、快速、靈敏檢測DNA的等溫核酸擴(kuò)增新方法。在第二章中,本論文基于鄰近效應(yīng)原理在等溫條件下構(gòu)建了DNA檢測的新方法。首先,設(shè)計(jì)了兩種實(shí)驗(yàn)方案,并對方案進(jìn)行了優(yōu)化。以副溶血性弧菌的特征序列為檢測靶標(biāo),對實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì),并對引物的長度和濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化。在最優(yōu)條件下對不同濃度的靶標(biāo)DNA進(jìn)行檢測,最低可以檢測到0.1fmol,且靶標(biāo)含量在100 fmol-0.1 fmol的范圍內(nèi),熒光信號的POI值與靶標(biāo)濃度呈良好的線性關(guān)系。該檢測方法操作簡單,反應(yīng)迅速、對儀器的依賴性低。在第三章中,本論文構(gòu)建了一種基于熒光探針檢測雙鏈DNA的新方法。該方法首先借助切刻內(nèi)切酶與聚合酶的聯(lián)合作用,在靶標(biāo)雙鏈DNA上引發(fā)線性鏈置換擴(kuò)增,將雙鏈DNA轉(zhuǎn)化為單鏈。然后利用設(shè)計(jì)的雙鏈熒光探針作為引物在單鏈DNA上引發(fā)后續(xù)反應(yīng),最終實(shí)現(xiàn)信號的級聯(lián)放大。該方法以大腸桿菌pBluescript II KS(+)(PBS)質(zhì)粒作為檢測對象,最低可以檢測到2.3 amol的PBS質(zhì)粒;且該方法具有較強(qiáng)的特異性,即使雙鏈熒光探針中只含有一個(gè)堿基錯(cuò)配也能將其有效的區(qū)分;為了檢驗(yàn)該方法在實(shí)際樣品中的應(yīng)用,在復(fù)雜體系下對靶標(biāo)進(jìn)行檢測,結(jié)果表明該方法具有較強(qiáng)的抗干擾能力�；谠摲椒ň哂泻唵慰焖�、特異性高、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),可為海產(chǎn)養(yǎng)殖中致病微生物,如副溶血性弧菌、霍亂弧菌等致病菌的檢測提供一個(gè)新的平臺(tái)。
【關(guān)鍵詞】：等溫核酸擴(kuò)增 副溶血性弧菌 分子信標(biāo) 核酸檢測 熒光探針
【學(xué)位授予單位】：青島科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R440
【目錄】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-9
• 第一章 文獻(xiàn)綜述9-37
• 1.1 等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)9-19
• 1.1.1 鏈置換擴(kuò)增10-12
• 1.1.2 滾環(huán)擴(kuò)增12-14
• 1.1.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增14-16
• 1.1.4 依賴解旋酶的等溫?cái)U(kuò)增16-18
• 1.1.5 交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)18-19
• 1.2 基于鄰近效應(yīng)的檢測方法19-24
• 1.2.1 基于鄰近效應(yīng)對蛋白質(zhì)的檢測方法20-22
• 1.2.2 基于鄰近效應(yīng)對核酸的檢測方法22-24
• 1.3 基于熒光探針的核酸檢測方法24-34
• 1.3.1 基于Taq Man探針的核酸檢測方法25-27
• 1.3.2 基于分子信標(biāo)的核酸檢測方法27-31
• 1.3.3 基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理的核酸檢測方法31-34
• 1.4 分子生物學(xué)技術(shù)在副溶血性弧菌檢測中的應(yīng)用34-35
• 1.4.1 副溶血性弧菌及其危害簡介34
• 1.4.2 副溶血性弧菌檢測方法34-35
• 1.5 本論文的研究意義與主要內(nèi)容35-37
• 第二章 基于鄰近效應(yīng)對DNA檢測的新方法研究37-56
• 2.1 引言37
• 2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)37-42
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)方案一38-40
• 2.2.1.1 實(shí)驗(yàn)原理38-39
• 2.2.1.2 DNA鏈的設(shè)計(jì)39-40
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)方案二40-42
• 2.2.2.1 實(shí)驗(yàn)原理40-41
• 2.2.2.2 DNA鏈的設(shè)計(jì)41-42
• 2.3 實(shí)驗(yàn)部分42-45
• 2.3.1 儀器與試劑42-43
• 2.3.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳的制備43-44
• 2.3.4 實(shí)時(shí)熒光檢測體系44-45
• 2.3.4.1 實(shí)驗(yàn)方案一的反應(yīng)體系44-45
• 2.3.4.2 實(shí)驗(yàn)方案二的反應(yīng)體系45
• 2.4 結(jié)果與討論45-55
• 2.4.1 實(shí)驗(yàn)方案一45-49
• 2.4.1.1 引物P的序列優(yōu)化45-46
• 2.4.1.2 副溶血性弧菌的檢測46-49
• 2.4.2 實(shí)驗(yàn)方案二49-55
• 2.4.2.1 實(shí)驗(yàn)機(jī)理的驗(yàn)證49-51
• 2.4.2.2 引物P與分子信標(biāo)結(jié)合長度的優(yōu)化51-52
• 2.4.2.3 引物P的濃度優(yōu)化52-53
• 2.4.2.4 副溶血性弧菌的檢測53-55
• 2.5 小結(jié)55-56
• 第三章 基于熒光探針檢測雙鏈DNA方法的研究56-67
• 3.1 引言56-57
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分57-60
• 3.2.1 儀器與試劑57-58
• 3.2.2 溶液的配制58
• 3.2.3 質(zhì)粒DNA及副溶血性弧菌基因組DNA的提取58-60
• 3.2.3.1 堿裂解法提取PBS質(zhì)粒DNA58-59
• 3.2.3.2 副溶血性弧菌基因組DNA的提取59-60
• 3.2.4 雙鏈熒光探針的雜交60
• 3.2.5 實(shí)時(shí)熒光檢測體系60
• 3.3 結(jié)果與討論60-65
• 3.3.1 實(shí)驗(yàn)原理60-62
• 3.3.2 DNA鏈的設(shè)計(jì)62
• 3.3.3 靈敏度檢測62-63
• 3.3.4 特異性檢測63-64
• 3.3.5 抗干擾檢測64-65
• 3.4 小結(jié)65-67
• 結(jié)論67-68
• 參考文獻(xiàn)68-77
• 附錄：論文中使用的縮略詞77-78
• 致謝78-79
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文目錄79-80

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 MA Wen li;DNA Diagnosis and Gene Therapy:Advances and Prospects in the 21st Century[J];深圳大學(xué)學(xué)報(bào);2000年04期

2 葛學(xué)銘,陸應(yīng)麟,付生法,范文紅,劉爽;A NOVEL HUMAN DNA SEQUENCE WITH TUMOR METASTASIS SUPPRESSIVE ACTIVITY[J];Chinese Journal of Cancer Research;2000年02期

3 曹暉,劉玉萍,小松かつ子,畢培曦,邵鵬柱;DNA Molecular Profiling:A New Approach to Quality Control of Chinese Drugs[J];Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine;2000年01期

4 ;DNA REPAIR CAPACITY IN LUNG CANCER PATIENTS[J];癌變.畸變.突變;2001年04期

5 黃力拉,朱剛勁;被拐賣及失蹤兒童采血驗(yàn)DNA前的心理問題及對策[J];齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2001年03期

6 安小惠 ,王一理 ,來寶長 ,耿一萍 ,司履生;CONSTRUCTION OF HUMAN INTERLUEKIN-18 DNA VACCINE AND IT'S EXPRESSION IN MAMMALIAN CELLS[J];Journal of Xi'an Medical University;2001年02期

7 ;A Study of PCR with DNA Extracted from Single Cell Isolated from Histological Sections[J];遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2001年01期

8 王軍陽,范桂香,勝利,袁育康;THE CONSTRUCTION AND PRELIMINARY APPRAISEMENT OF HSV-2 gD GENE DNA VACCINE[J];Academic Journal of Xi'an Jiaotong University;2002年02期

9 董菁 ,成軍 ,王勤環(huán) ,施雙雙 ,王剛 ,斯崇文;CLONING AND ANALYSIS OF THE GENOMIC DNA SEQUENCE OF AUGMENTER OF LIVERR EGENERATION FROM RAT[J];Chinese Medical Sciences Journal;2002年02期

10 ;Real time observation of the photocleavage of single DNA molecules[J];Chinese Science Bulletin;2003年07期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 Michael J.Siefkes;Cory O.Brant;Ronald B.Walter;;A novel real-time XL-PCR for DNA damage detection[A];漁業(yè)科技創(chuàng)新與發(fā)展方式轉(zhuǎn)變——2011年中國水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2011年

2 ;Hormonal Regulation and Tumorigenic Role of DNA Methyltransferase[A];2011中國婦產(chǎn)科學(xué)術(shù)會(huì)議暨浙江省計(jì)劃生育與生殖醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)暨生殖健康講習(xí)班論文匯編[C];2011年

3 Dongmei Zhao;Fan Jin;Yuli Qian;Hefeng Huang;;Expression patterns of Dnmtl and Dnmt3b in preimplantational mouse embryos and effects of in-vitro cultures on their expression[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十次全國婦產(chǎn)科學(xué)術(shù)會(huì)議婦科內(nèi)分泌會(huì)場（婦科內(nèi)分泌學(xué)組、絕經(jīng)學(xué)組、計(jì)劃生育學(xué)組）論文匯編[C];2012年

4 姜東成;蔣稼歡;楊力;蔡紹皙;K.-L.Paul Sung;;在聚吡咯微點(diǎn)致動(dòng)下的DNA雜交行為[A];2008年全國生物流變學(xué)與生物力學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2008年

5 白明慧;翁小成;周翔;;聯(lián)鄰苯二酚類小分子作為DNA交聯(lián)劑的研究[A];第六屆全國化學(xué)生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

6 張曄;杜智;楊斌;高英堂;;檢測外周血中游離DNA的應(yīng)用前景(綜述)[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第29屆學(xué)術(shù)年會(huì)暨首屆生物醫(yī)學(xué)工程前沿科學(xué)研討會(huì)論文集[C];2009年

7 周紅;鄭江;王良喜;丁國富;魯永玲;潘文東;羅平;肖光夏;;CpG DNA誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)綜合征的作用及其機(jī)制研究[A];全國燒傷創(chuàng)面處理、感染專題研討會(huì)論文匯編[C];2004年

8 ;EFFECTS OF Ku70-DEFICIENT ON ARSENITE-INDUCED DNA DOUBLE STRAND BREAKS, CHROMOSOMAL ALTERATIONS AND CELL CYCLE ARREST[A];海峽兩岸第三屆毒理學(xué)研討會(huì)論文摘要[C];2005年

9 李經(jīng)建;冀中華;蔡生民;;小溝結(jié)合方式中的DNA媒介電荷轉(zhuǎn)移[A];第十三次全國電化學(xué)會(huì)議論文摘要集（下集）[C];2005年

10 ;The interaction between Levofloxacine Hydrochloride and DNA mediated by Cu~(2+)[A];湖北省化學(xué)化工學(xué)會(huì)2006年年會(huì)暨循環(huán)經(jīng)濟(jì)專家論壇論文集[C];2006年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 本報(bào)記者 袁滿;平安：把“領(lǐng)先”作為DNA[N];經(jīng)濟(jì)觀察報(bào);2006年

2 舒放;編織一個(gè)DNA納米桶[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2006年

3 閆潔;英兩無罪公民起訴要求銷毀DNA記錄[N];新華每日電訊;2008年

4 何德功;日本制成診斷魚病的“DNA書”[N];農(nóng)民日報(bào);2004年

5 本報(bào)記者 張巍巍;DNA樣本也能作假[N];科技日報(bào);2009年

6 周斌偉　鄒巍;蘇州警方應(yīng)用DNA技術(shù)一年偵破案件1887起[N];人民公安報(bào);2011年

7 本報(bào)記者 楊天笑;揭秘“神探”DNA[N];蘇州日報(bào);2011年

8 第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室教授 李福洋;破除法老DNA的咒語[N];東方早報(bào);2011年

9 常麗君;DNA電路可檢測導(dǎo)致疾病的基因損傷[N];科技日報(bào);2012年

10 常麗君;效率和質(zhì)量：“DNA制造業(yè)”兩大障礙被攻克[N];科技日報(bào);2012年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 唐陽;基于質(zhì)譜技術(shù)的基因組DNA甲基化及其氧化衍生物分析[D];武漢大學(xué);2014年

2 池晴佳;DNA動(dòng)力學(xué)與彈性性質(zhì)研究[D];重慶大學(xué);2015年

3 胡璐璐;哺乳動(dòng)物DNA去甲基化過程關(guān)鍵酶TET2的三維結(jié)構(gòu)與P暬蒲芯縖D];復(fù)旦大學(xué);2014年

4 馬寅洲;基于滾環(huán)擴(kuò)增的DNA自組裝技術(shù)的研究[D];南京大學(xué);2014年

5 黃學(xué)鋒;精子DNA碎片的臨床意義：臨床和實(shí)驗(yàn)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

6 隋江東;APE1促進(jìn)DNA-PKcs介導(dǎo)hnRNPA1磷酸化及其在有絲分裂期端粒保護(hù)中的作用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

7 劉松柏;結(jié)構(gòu)特異性核酸酶FEN1在DNA復(fù)制及細(xì)胞周期過程中的功能性研究[D];浙江大學(xué);2015年

8 王璐;哺乳動(dòng)物中親本DNA甲基化的重編程與繼承[D];中國科學(xué)院北京基因組研究所;2015年

9 齊文靖;染色質(zhì)改構(gòu)蛋白BRG1在DNA雙鏈斷裂修復(fù)中的作用及機(jī)制研究[D];東北師范大學(xué);2015年

10 龍湍;水稻T-DNA插入突變?nèi)后w側(cè)翼序列的分離分析和OsaTRZ2的克隆與功能鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

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1 董洪奎;面向可視化納米操作的DNA運(yùn)動(dòng)學(xué)建模及誤差實(shí)時(shí)校正方法[D];沈陽理工大學(xué);2014年

2 聞金燕;水溶性羧基和吡啶基咔咯大環(huán)與DNA和人血清蛋白的相互作用[D];華南理工大學(xué);2015年

3 江懌雨;水溶性羧酸卟啉及其配合物與DNA和人血清蛋白的相互作用[D];華南理工大學(xué);2015年

4 高志森;比較外周游離循環(huán)腫瘤DNA與癌胚抗原監(jiān)測非小細(xì)胞肺癌根治術(shù)前后腫瘤負(fù)荷變化的初步研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

5 丁浩;血漿循環(huán)DNA完整性及多基因甲基化對肺癌診斷價(jià)值的研究[D];河北大學(xué);2015年

6 王鵬;基于碳點(diǎn)@氧化石墨烯復(fù)合材料DNA生物傳感器的構(gòu)建及用于PML/RARα基因檢測[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

7 李海青;轉(zhuǎn)堿篷和鹽角草總DNA的耐鹽紫花苜蓿的選育[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

8 李婷婷;小鼠DNA模式識別重要受體的分子結(jié)構(gòu)特征及其功能研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

9 劉瑞斯;抗癌藥物奧沙利鉑與DNA相互作用的原子力顯微鏡觀察研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

10 熊忠;芳香二肽與一價(jià)金屬離子間相互作用及DNA切割活性的研究[D];鄭州大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：DNA等溫?cái)U(kuò)增檢測副溶血性弧菌的新技術(shù)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：392633