呼吸道感染給人類造成了嚴重的疾病負擔,特別是對于兒童的生命健康構成了極大的威脅。能夠?qū)е氯祟惡粑栏腥镜牟≡w種類繁多,超過80%的病例由病毒感染引起,而重癥及死亡病例則主要歸因于細菌的感染。準確掌握呼吸道感染的病原譜,可以為制訂相關傳染病的防控策略提供依據(jù);臨床上及早明確病原體,進行針對性的抗感染治療則是控制感染的關鍵環(huán)節(jié)。目前常規(guī)使用的病原體鑒定方法:如病原體培養(yǎng)、血清學檢測、免疫學檢測等存在著耗費時間長、靈敏度低等缺點。以PCR技術為代表的分子檢測方法靈敏快速,但大多無法兼顧病原體覆蓋廣度和樣本檢測通量這兩個關鍵因素。同時,一些較為先進的檢測技術卻因昂貴的檢測費用而難以廣泛應用。鑒于此,本課題的目標是建立一種高效、廉價的呼吸道病原體檢測方法。在本課題中,我們使用MassARRAY系統(tǒng)作為檢測平臺,利用多重PCR與MALDI-TOF質(zhì)譜技術聯(lián)用來鑒定目標病原體。通過對呼吸道病原體流行病學、檢測方法的指南和文獻進行綜述,我們選擇在呼吸道感染中常見、并且與疾病發(fā)生相關的病原體納入檢測范圍。對于每一種目標病原體,選擇種間特異且種內(nèi)保守的基因作為檢測靶基因。根據(jù)不同的病原體類別,其序列的收... 

【文章來源】：北京協(xié)和醫(yī)學院北京市211工程院校985工程院校

【文章頁數(shù)】：114 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

R自，sA}RA}系統(tǒng)的檢狽J原理

圖１３：人偏肺病毒Ａ、Ｂ亞型，人呼吸道合胞病毒Ａ、Ｂ亞型、人博卡病毒１型、??２型特異度評價結(jié)果。每個目標病原的一組質(zhì)譜圖中，上圖為陰性樣本的檢測結(jié)果，??下圖為陽性樣本的檢測結(jié)果。??４．３．２?ＲＶ－ＭＳ靈敏度的評價??我們將ＲＶ－ＭＳ的每一個檢測靶基因克隆進入載體，根據(jù)定量結(jié)果進行稀釋，??制備十倍質(zhì)粒梯度，用ＲＶ－ＭＳ測試１拷貝每反應，至１００００拷貝每反應，五個濃??度梯度，每個梯度進行三次重復實驗。對于ＲＶ－ＭＳ，在１００拷貝每反應濃度，所有??的目標病原體三次重復都能檢測得到陽性結(jié)果，在１０拷貝每反應濃度，部分重復??實驗可以觀察到陽性結(jié)果。據(jù)此我們估計，ＲＶ－ＭＳ的檢出限大約在１０－１００拷貝每??６８??

北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院?博士學位論文??４．４．２?ＲＢ－ＭＳ靈敏度的評價??評價方法與實驗流程同４．３．２節(jié)ＲＶ－ＭＳ靈敏度評價。評價的結(jié)果與ＲＶ－ＭＳ?—??致，ＲＢ－ＭＳ的檢出限大約在１０－１００拷貝每反應之間。圖１６是部分ＲＢ－ＭＳ靈敏度??評價的實驗結(jié)果。??（Ａ）?Ｈｏｅｍｏｐｈｉｌｖｓ?ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ?（Ｂ）?Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ?ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ??２０ｔ?１?２０ｆ?＜．?－＞??


本文編號：3622863