發(fā)布時間：2021-12-16 04:27

　　宮頸癌是全球女性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因,其發(fā)病率在過去幾十年不斷增加。雖然早期宮頸癌可以通過手術(shù)或放療進行治療,但晚期宮頸癌幾乎是無法治愈的,需要新的治療方法。放療是宮頸癌的常規(guī)治療手段,增強放療的殺傷效應(yīng)至關(guān)重要。線粒體是細胞中重要的細胞器,參與細胞各種活動,如能量產(chǎn)生、代謝、信號傳導(dǎo)、細胞自噬與凋亡等多種活動,近年來線粒體和活性氧（ROS）作為癌癥治療靶點已成為熱點。KillerRed（KR）是一種可遺傳編碼的二聚體紅色熒光蛋白光敏劑,相對于化學(xué)光敏劑的主要優(yōu)點是其在用適當基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可在腫瘤細胞中表達,并通過對靶細胞區(qū)室的精確損傷直接殺死細胞。在可見光照射下可產(chǎn)生大量ROS,利用ROS破壞癌細胞。本研究通過Pink1（PTEN induced putative kinase 1）的線粒體靶向序列（mitochondrial targeting sequence,MTS）介導(dǎo)KR亞定位于線粒體,進而可見光照射誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生,從而增強電離輻射對宮頸癌的殺傷作用,并探討其殺傷效應(yīng)及分子機制。目的:研究Pink1線粒體靶向序列的線粒體亞定位功能,并以人宮頸癌HeLa細胞為對象,探討可見光照... 

【文章來源】：吉林大學(xué)吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：88 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

Pink1-mtKR轉(zhuǎn)染HeLa細胞后ROS的含量測定

Figure 3.1 Development of vectors for mtmCherry and mtKR.3.1.2 構(gòu)建載體的線粒體亞定位功能鑒定Pink1 具有線粒體靶向序列，編碼的蛋白能使該蛋白定位在線粒體外膜上，在本研究中利用這段序列與下游序列構(gòu)建成融合表達載體也應(yīng)該亞定位與線粒體上。因 KR 蛋白光照后喪失活性，所以不適于熒光顯微鏡觀察，用氨基酸序列與其基本一致的紅色熒光蛋白 mCherry 代替 KR 蛋白，進行線粒體亞定位鑒定。將 Pink1-mtmCherry 轉(zhuǎn)染 COS-7 和 HeLa 細胞，并檢測線粒體示蹤蛋白 COXⅣ與mCherry 蛋白的表達，并用熒光顯微鏡觀察結(jié)果并拍照（圖 3.2）。線粒體標志分子 COXⅣ顯示綠色熒光，定位于線粒體，mCherry 為紅色熒光蛋白，結(jié)果顯示，在兩種不同細胞中，mCherry 與 COXⅣ均有共定位現(xiàn)象，證明重組質(zhì)粒載體Pink1-mtmCherry 可以亞定位于線粒體，表明 Pink1-MTS 具有線粒體亞定位能力，可以將 KR 亞定位到線粒體上，為后續(xù)實驗提供了保證。

× 200Figure 3.2 The mtmCherry co-localized the mitochondria with COX IV, × 200.3.2 ROS 含量檢測為了研究所構(gòu)建的重組質(zhì)粒是否可以通過可見光照射誘導(dǎo)細胞產(chǎn) ROS，將plxsp-flag（Empty vector）、plxsp-flag-Pink1-KillerRed（Pink1-mtKR）分別轉(zhuǎn)染進HeLa 細胞中，利用 DCFH-DA 染色，檢測平均熒光強度。由圖 3.3 可見，光照前KR 蛋白為紅色熒光，30 h 左右紅色熒光值最大，其轉(zhuǎn)染效率最高；而照射后紅色熒光減少，暗示 KR 失活，同時 DCFH-DA 可將 HeLa 細胞染成綠色，而比未處理的 Hela 細胞（圖 3.4 a 和 b）相比，表明用可見光照射 KR 會產(chǎn)生 ROS。


本文編號：3537481