本文關(guān)鍵詞：酸敏感聚（原酸酯氨基醇）的設(shè)計、制備及轉(zhuǎn)染性能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：基因治療作為一種全新的疾病治療手段越來越受到人們的廣泛關(guān)注,它通過將治療基因?qū)氩』冀M織和細(xì)胞以取代或修復(fù)致病基因的缺失,從而達到治愈疾病的目的。目前,基因治療可應(yīng)用于那些威脅人類生命的重大疾病,例如癌癥、血友病、心血管疾病、病毒感染等。然而,基因治療的關(guān)鍵問題在于缺乏安全高效的介導(dǎo)基因傳遞的載體。與病毒載體相比,非病毒載體由于安全性高、分子結(jié)構(gòu)可靈活設(shè)計且易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點已成為人們研究的重點,特別是陽離子聚合物基因載體。目前研究較多的陽離子聚合物基因載體包含聚甲基丙烯酸-N,N’-二甲氨基乙酯(PDMAEMA)、聚乙烯亞胺(PEI)、聚賴氨酸(PLL)等。實驗證明這些聚陽離子載體都能夠高效地結(jié)合并壓縮DNA形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物,并且顯示出較好的體外轉(zhuǎn)染效果。然而,它們具有的不可生物降解性、高分子量、高電荷密度的特點也導(dǎo)致了高細(xì)胞毒性和阻礙細(xì)胞內(nèi)釋放DNA；除此之外,在介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)染實驗中,這些聚陽離子載體會與帶負(fù)電荷的血液成分相互作用,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率大幅度降低。本研究的目的是設(shè)計并制備一種新型的聚陽離子基因載體--聚(原酸酯氨基醇)(POEAAs)。該種聚合物的特點為主鏈中含有均勻分布的叔氨基和羥基,而側(cè)鏈通過酸敏感原酸酯鍵鍵合三級氮。為了優(yōu)化設(shè)計良好水溶性和高效壓縮質(zhì)粒DNA的聚陽離子基因載體POEAAs,本論文通過氨基原酸酯單體(AOE)分別與乙二醇二縮水甘油醚(EGDE)和聚乙二醇二縮水甘油醚(PEGDE)之間的開環(huán)聚合反應(yīng)合成了兩種聚(原酸酯氨基醇)-POEAA1和POEAA2。在內(nèi)涵體酸性環(huán)境下,通過POEAAs側(cè)鏈上原酸酯鍵水解引起的三級氮斷裂以及主鏈上均勻分布的叔氨基來精確調(diào)控細(xì)胞內(nèi)DNA釋放,從而提高轉(zhuǎn)染效率。具體來說,一方面POEAAs聚合物側(cè)鏈上原酸酯鍵水解引起的三級氮斷裂導(dǎo)致復(fù)合物解體,從而促進內(nèi)涵體逃逸,同時釋放DNA；另一方面,POEAAs聚合物主鏈上均勻分布的叔氨基又可以結(jié)合和保護DNA,避免復(fù)合物釋放DNA過快而導(dǎo)致DNA被內(nèi)涵體內(nèi)的核酸酶降解。通過POEAAs主鏈上均勻分布的羥基來提高載體/DNA復(fù)合物的生物相容性和血清條件下的轉(zhuǎn)染效率。論文主要開展了以下工作：第一章：介紹了基因治療和基因傳遞體系的概況,常用非病毒基因傳遞系統(tǒng)以及刺激響應(yīng)性聚陽離子基因載體的制備與應(yīng)用,陽離子聚合物載體介導(dǎo)基因傳遞面臨的障礙及解決措施。第二章：通過AOE分別與EGDE和PEGDE之間的開環(huán)聚合反應(yīng)合成POEAA1和POEAA2,對二者的結(jié)構(gòu)、分子量及分子量分布進行了表征,并檢測了POEAAs的酸敏感性。結(jié)果表明,POEAA1和POEAA2在溫和的酸性條件下均能水解,且遵循環(huán)外機制,在偏酸性條件下,降解程度逐漸隨著時間的延長逐漸增強。第三章：評價了POEAAs壓縮DNA的能力、POEAAs/DNA復(fù)合物的血清穩(wěn)定性,測定了POEAAs/DNA復(fù)合物的粒徑及Zeta電位,最后探索了POEAAs/DNA復(fù)合物在酸性條件下釋放DNA的能力。結(jié)果表明,在生理條件下,POEAA1和POEAA2均能夠高效地結(jié)合和壓縮DNA,且POEAA2結(jié)合DNA的能力略強于POEAA1。隨著N/P比的增加,POEAA1和POEAA2的粒徑逐漸減小,最終穩(wěn)定在150-220 nm左右；POEAA1和POEAA2的Zeta電位隨著N/P比的增加呈現(xiàn)上升的趨勢,最終分別穩(wěn)定在9 mV和23 mV左右。相對于25 kDabPEI, POEAAs/DNA復(fù)合物具有更強的抗酶能力、抗陰離子聚合物能力和抑制蛋白吸附能力,因而可以證明POEAAs/DNA復(fù)合物具有優(yōu)良的血清穩(wěn)定性。POEAAs/DNA復(fù)合物在酸性條件下能釋放DNA,釋放速率隨著時間的延長而增大,且POEAA1/DNA釋放DNA更快且釋放量更多。第四章：評價了POEAAs介導(dǎo)293T細(xì)胞的毒性以及POEAAs介導(dǎo)293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染效率以及血清對轉(zhuǎn)染效率的影響。結(jié)果表明,與25 kDa bPEI(對照組)相比,POEAAs的細(xì)胞毒性明顯更低,甚至當(dāng)POEAAs的濃度為1 mg/mL時,細(xì)胞的存活率達到了80%以上,而當(dāng)25 KDa bPEI的濃度為1 mg/mL時,細(xì)胞存活率不到20%；而且POEAA1細(xì)胞毒性比POEAA2更低。在無血清條件下,與25 KDa bPEI介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率(26.3%)相比,POEAAs的轉(zhuǎn)染效率(4.12%)較低,但是在含10%血清的條件下,POEAAs介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率(4.93%)與25 KDabPEI(6.57%)的幾乎相當(dāng)。POEAAs的轉(zhuǎn)染效率不受10%血清濃度的影響,這對于聚陽離子基因載體介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)染是重要的。綜上所述,本工作制備的陽離子共聚物(POEAAs)具有良好的生物相容性、血清穩(wěn)定性及精確調(diào)控DNA釋放的能力,有望成為具有良好應(yīng)用前景的聚合物基因載體。
【關(guān)鍵詞】：原酸酯 轉(zhuǎn)染 基因傳遞
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R450
【目錄】：

• 摘要3-6
• Abstract6-12
• 第一章 引言12-23
• 1.1 基因治療概述12
• 1.2 基因傳遞體系12-16
• 1.2.1 非病毒基因傳遞系統(tǒng)13-16
• 1.2.1.1 聚乙烯亞胺(PEI)14
• 1.2.1.2 樹狀高分子聚酰胺-胺(PAMAM)14-15
• 1.2.1.3 聚賴氨酸(PLL)15-16
• 1.2.1.4 殼聚糖(CS)16
• 1.3 刺激響應(yīng)性聚陽離子基因載體16-18
• 1.3.1 pH敏感基因載體17
• 1.3.2 氧化還原敏感基因載體17-18
• 1.3.3 溫度敏感基因載體18
• 1.4 陽離子聚合物載體介導(dǎo)基因傳遞面臨的障礙及解決措施18-21
• 1.4.1 血液循環(huán)的穩(wěn)定性19
• 1.4.2 靶向細(xì)胞攝取19-20
• 1.4.3 內(nèi)涵體逃逸20-21
• 1.4.4 細(xì)胞核進入21
• 1.5 選題思路及研究內(nèi)容21-23
• 1.5.1 選題思路21-22
• 1.5.2 研究內(nèi)容22-23
• 第二章 酸敏感聚(原酸酯氨基醇)的制備與表征23-37
• 2.1 引言23
• 2.2 實驗試劑及儀器23-25
• 2.2.1 實驗試劑23-24
• 2.2.2 實驗儀器24-25
• 2.3 實驗內(nèi)容25-28
• 2.3.1 實驗試劑的純化25
• 2.3.2 AOE的合成25-27
• 2.3.3 聚(原酸酯氨基醇)(POEAAs)的合成27-28
• 2.4 表征方法28-29
• 2.4.1 核磁共振氫譜(~1H NMR)檢測28
• 2.4.2 凝膠滲透色譜(GPC)檢測28
• 2.4.3 聚(原酸酯氨基醇)(POEAAs)的酸敏感性檢測28-29
• 2.4.3.1 不同pH緩沖溶液的配制28-29
• 2.4.3.2 POEAAs的酸敏感性檢測29
• 2.5 結(jié)果與討論29-36
• 2.5.1 化合物2的~1H NMR圖譜分析29-30
• 2.5.2 AOE的~1H NMR圖譜分析30-31
• 2.5.3 POEAAs的~1H NMR圖譜分析31-32
• 2.5.4 POEAAs的GPC分析32-33
• 2.5.5 POEAAs的酸敏感性結(jié)果分析33-36
• 2.6 本章小結(jié)36-37
• 第三章 POEAAs/DNA復(fù)合物的制備與表征37-53
• 3.1 引言37
• 3.2 實驗試劑及儀器37-38
• 3.2.1 實驗試劑37-38
• 3.2.2 實驗儀器38
• 3.3 實驗方法38-44
• 3.3.1 質(zhì)粒DNA的大量制備與純化38-40
• 3.3.1.1 E.coliDH5α的培養(yǎng)39
• 3.3.1.2 質(zhì)粒的提取39-40
• 3.3.2 POEAAs/DNA復(fù)合物的制備40-41
• 3.3.3 瓊脂糖凝膠電泳阻滯實驗41
• 3.3.4 EB排阻實驗41
• 3.3.5 粒徑和Zeta電位測定41-42
• 3.3.6 DNase Ⅰ酶解實驗42
• 3.3.7 肝素置換實驗42
• 3.3.8 BSA蛋白吸附實驗42-44
• 3.3.9 復(fù)合物釋放DNA實驗44
• 3.4 結(jié)果與討論44-52
• 3.4.1 瓊脂糖凝膠電泳阻滯實驗44-45
• 3.4.2 EB排阻實驗45-46
• 3.4.3 粒徑和Zeta電位的測量46-47
• 3.4.4 DNase Ⅰ酶解實驗47-48
• 3.4.5 肝素置換實驗48-49
• 3.4.6 BSA蛋白吸附實驗49-50
• 3.4.7 復(fù)合物釋放DNA實驗50-52
• 3.5 本章小結(jié)52-53
• 第四章 聚陽離子載體POEAAs介導(dǎo)體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染及細(xì)胞毒性研究53-62
• 4.1 引言53
• 4.2 實驗試劑及儀器53-54
• 4.2.1 實驗試劑53-54
• 4.2.2 實驗儀器54
• 4.3 實驗方法54-57
• 4.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)54-55
• 4.3.2 細(xì)胞毒性實驗55-56
• 4.3.3 POEAAs介導(dǎo)293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗56-57
• 4.4 結(jié)果與討論57-61
• 4.4.1 POEAAs的細(xì)胞毒性57-58
• 4.4.2 POEAAs介導(dǎo)293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染58-61
• 4.5 本章小結(jié)61-62
• 主要結(jié)論與展望62-63
• 參考文獻63-72
• 致謝72-73
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄73

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