澳洲堅(jiān)果屬樹類堅(jiān)果,具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,但是其過敏原蛋白能夠引起部分人群產(chǎn)生過敏反應(yīng)。目前防止過敏的有效方法是避免過敏人群對(duì)過敏原的接觸,因此,建立澳洲堅(jiān)果蛋白的有效檢測(cè)方法具有重要意義。本論文優(yōu)化建立了澳洲堅(jiān)果全蛋白的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法,并應(yīng)用于熱加工食品中日的蛋白的檢測(cè)。采用硫酸銨沉淀法提取澳洲堅(jiān)果全蛋白,并將其作為抗原免疫新西蘭大白兔和BALB/c小鼠制備兔多克隆抗體和鼠多克隆抗體。交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明,所制備抗體除能識(shí)別開心果和榛果的部分蛋白外,與大豆、核桃、杏仁、花生、腰果和小麥中的蛋白均沒有識(shí)別,說明所制備抗體特異性較好。利用兔多克隆抗體優(yōu)化建立了間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫方法,抗原包被量為0.025μg/well,封閉液為1%脫脂乳粉,兔抗稀釋倍數(shù)為1:16000,羊抗兔HRP-酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為1:20000。該方法的檢測(cè)限IC15為5.12±0.57 ng/mL,IC50為63.94±0.85 ng/mL。以兔多抗作為捕獲抗體,鼠多抗作為檢測(cè)抗體,優(yōu)化建立了雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法,捕獲抗體包被量為0.05 μg/well,封閉液為0.5%脫脂乳粉,檢測(cè)抗體稀釋倍數(shù)為1:2000,羊... 

【文章來源】：天津科技大學(xué)天津市

【文章頁(yè)數(shù)】：56 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖３－１澳洲堅(jiān)果過敏原蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳??Ｆｉｇ．?３－１?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ｏｆ?ｍａｃａｄａｍｉａ?ｎｕｔ?ａｌｌｅｒｇｅｎ??

Ｍ．?Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｓｔａｎｄａｒｄ；?１－３：?Ｔｈｅ?ｌｏａｄｉｎｇ?ｑｕａｎｔｉｔｙ?ｏｆ?ｍａｃａｄａｍｉａ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｗｅｒｅ７．５??ｆｉｇ、５?ｆｉｇ?ａｎｄ?２．５?卜ｉｇ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ??如圖３－２可知，兔多克隆抗體主要特異性識(shí)別澳洲堅(jiān)果中存在的四種蛋白；鼠??多克隆抗體主要特異性識(shí)別澳洲堅(jiān)果中存在的兩種蛋白。這兩種抗體結(jié)合的蛋白條??帶存在差異，但澳洲堅(jiān)果蛋白中存在兩種主要蛋白均能被特異性識(shí)別。??３．５間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立??３．５．１包被量和檢測(cè)抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化??澳洲堅(jiān)果蛋白包被量分別選擇〇．丨ｐｇ／孔、０．０５?＾ｉｇ／孔和０．０２５?ｎｇ／孔，兔抗分別以??１：?８０００、１：?１６０００、１：?３２０００的比例進(jìn)行稀釋，通過棋盤法對(duì)間接競(jìng)爭(zhēng)ＥＬＩＳＡ進(jìn)??行初步優(yōu)化，根據(jù)測(cè)定的最大吸光度值計(jì)算相應(yīng)的抑制率，繪制抑制率曲線，最后??通過抑制率曲線公式計(jì)算出抑制率為５０％時(shí)所對(duì)應(yīng)的蛋〇濃度，即ＩＣ５〇。由表３－４??可知，抗原的包被量與兔多抗稀釋倍數(shù)對(duì)〇＿和１（：５（）的影響很大。選取最大吸光度??值在０．８－１．２左右，且對(duì)應(yīng)的ＩＣ５（）最小的組合作為最優(yōu)組合。因此，本實(shí)驗(yàn)的最佳組??合是包被量為０．０２５?＃／孔

二抗以１：２００００稀釋，２５°（：反應(yīng)３０１１１丨１１。其他操作按照２．２．６．１，最后用酶標(biāo)儀在??４５０－６５０?ｎｍ讀取每孔的對(duì)應(yīng)吸光度值（即ＯＤ值）。以蛋白濃度作為橫坐標(biāo)，吸光??度值作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖３－６為雙抗夾心ＥＬＩＳＡ檢測(cè)澳洲堅(jiān)果過敏原蛋白??的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)定義計(jì)算ＬＯＤ值與ＬＯＱ值，得到澳洲堅(jiān)果的ＬＯＤ值為０．９５?±?０．１７??ｎｇ／ｍＬ，ＬＯＱ?值為?３．１３?±?０．５７?ｎｇ／ｍＬ。??０．９?ｒ??〇８?Ｌ?■?Ｙ＝０．０２３４ｘ－０．０８９２??■?Ｒ２＝０．Ｗ７??０．７?－??ｏ?０．６?－??１０４：?Ｘ??＾?０．３?－?ｉＸ??￣?０．２－??０．１?ｒ??０．０——１——１——１——１——＊——１——？——１——■——１——？——１——１??０?５?１０?１５?２０?２５?３０??澳洲％果過敏原蛋Ｉ＇〗濃度（ｎｇ／ｍＬ）??圖３－７澳洲堅(jiān)果過敏原蛋白雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線??Ｆｉｇ．?３－７?Ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ｍａｃａｄａｍｉａ?ｎｕｔ?ａｌｌｅｒｇｅｎｓ?ｏｎ?ｓａｎｄｗｉｃｈ?ＥＬＩＳＡ??通過上述實(shí)驗(yàn)可知，雙抗夾心ＥＬＩＳＡ方法的檢測(cè)限（ＬＯＤ）為０．９５?±０．１７?ｎｇ／ｍＬ，??間接競(jìng)爭(zhēng)ＥＬＩＳＡ方法的檢測(cè)限為５．１２?±?０．５７?ｎｇ／ｍＬ。與間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法??相比，雙體夾心ＥＬＩＳＡ方法靈敏度更高。這是由于在雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法中，??選用了兔多抗和鼠多抗兩種動(dòng)物制備的抗體，它們都能與澳洲堅(jiān)果過敏原表面的不??同結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合

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碩士論文
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本文編號(hào)：3040894