本文關(guān)鍵詞：肌成纖維細胞在放射性頜骨骨壞死發(fā)生機制中作用的初步實驗研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：放射性頜骨骨壞死(osteoradionecrosis of jaws,ORNJ)是一種嚴(yán)重的放療后并發(fā)癥,一旦發(fā)生,很難逆轉(zhuǎn),沒有自愈傾向。ORNJ通常會在放射治療后幾周或三年內(nèi)出現(xiàn)。ORNJ主要的臨床體征為長期不愈合的粘膜潰瘍及死骨外露,嚴(yán)重病例也可形成竇道以及病理性骨折,患者表現(xiàn)為劇烈疼痛、張口受限等。ORNJ臨床危害性大,并缺乏有效的預(yù)防措施和治療方法,一旦發(fā)生ORNJ,通常需要多次手術(shù)治療,這會嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。造成ORNJ預(yù)防與治療困難的主要原因是其發(fā)病機制至今仍未完全清楚。ORNJ的發(fā)病機制一直是國內(nèi)外研究熱點,以往的各種發(fā)病學(xué)說,如放射、創(chuàng)傷、感染理論學(xué)說(radiation,trauma,infection theory)與低氧—低細胞—低血管的三低學(xué)說(hypoxic-hypocellular-hypovascular theory)及其衍生出的治療方法均被證實存在明顯缺陷。近些年來,有學(xué)者提出了放射性纖維萎縮學(xué)說,認為ORNJ是一種放療誘導(dǎo)的纖維化疾病,或稱為放射性纖維化(radiation-induced fibrosis,RIF),并且臨床試驗也證實了采用抗纖維化藥物治療ORNJ可取得明顯的療效。隨著臨床試驗的進一步深入,已有研究人員根據(jù)放射性纖維萎縮學(xué)說提出了不同的ORNJ診斷與分型方法。但此學(xué)說尚缺乏具體的實驗依據(jù)支持,ORNJ的具體纖維化過程并未完全闡明。根據(jù)目前對纖維化疾病的研究成果,我們認為肌成纖維細胞(myofibroblast,MFB)是纖維化疾病的主要效應(yīng)細胞,其過度增殖、過量合成膠原以及促進細胞外基質(zhì)堆積是造成纖維化的主要原因,也是目前纖維化治療的重要靶點。但mfb是否也在ornj的發(fā)生中起重要作用仍不明確,尚缺乏關(guān)于ornj纖維化機制的實驗室研究。因此,本研究通過建立能夠體現(xiàn)rif完整病程的ornj動物模型,觀察在ornj不同階段纖維化與骨破壞之間的關(guān)系,同時觀察病變組織中mfb的表達、分布特點、分化調(diào)控及細胞來源,以期進一步闡明ornj的放射性纖維化發(fā)病機制,為ornj的實驗室研究提供新的研究平臺,并對ornj預(yù)防和治療提供新的思路和指導(dǎo)。具體內(nèi)容包括以下四個部分:一.ornj動物模型的建立及評估目的:依據(jù)ornj新的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn),建立一種可模擬ornj不同臨床分期的復(fù)合型動物模型。方法:健康sd雄性大鼠36只,隨機分為6組:a1、b1、c1為實驗組,a0、b0、c0組為對照組;根據(jù)生物學(xué)等效公式bed=nd[1+d/(α/β)],實驗組采用電子直線加速器對大鼠左側(cè)下頜區(qū)進行照射,7gy/次,1次/d,照射5d;照射后6w,處死a1、a0組大鼠,并拔除b1、b0、c1、c0組大鼠左側(cè)下頜磨牙;照射12w、18w后,分別處死b1、b0組大鼠和c1、c0組大鼠并取下頜骨標(biāo)本。對所有標(biāo)本進行組織學(xué)觀察和顯微ct掃描與骨組織顯微形態(tài)分析。結(jié)果:實驗組照射區(qū)可見,a1組門齒生長障礙,b1組死骨暴露,c1組咬合錯亂,化膿性感染與病理性骨折等癥狀,對照組無癥狀。組織學(xué)觀察可見,實驗組照射區(qū)骨髓腔與牙周膜內(nèi),炎性細胞浸潤、纖維組織增生,b1、c1組還可見游離死骨;實驗組門齒牙根與皮質(zhì)骨漸進性破壞,c1組部分大鼠門齒牙根結(jié)構(gòu)消失,周圍皮質(zhì)骨不連續(xù);實驗組空白骨陷窩增多,骨陷窩內(nèi)骨細胞減少。顯微ct結(jié)果顯示:實驗組相對骨體積(bv/tv)均低于對照組;實驗組間bv/tv值相比,a1b1c1。結(jié)論:建立了一種能夠模擬出輕度無癥狀(a1)、中度死骨暴露(b1)與重度聯(lián)合癥狀(c1)三種不同ornj分型的復(fù)合型動物模型,為針對性研究ornj治療方法提供了實驗平臺。二.mfb在ornj組織中表達特點的研究目的:觀察mfb在sd大鼠照射區(qū)組織中的表達及分布特點,并觀察組織中與mfb的轉(zhuǎn)化和纖維化相關(guān)的上下游分子的表達情況。方法:對實驗組與對照組的照射區(qū)組織標(biāo)本進行mfb特異性分子標(biāo)志物α-sma的免疫組織化學(xué)染色和和半定量分析,觀察ornj中mfb的數(shù)量變化、組織定位并觀察其隨時間的變化情況;應(yīng)用western-blot法對mfb相關(guān)的上下游分子tgf-β1、ctgf、colⅠ、colⅢ的表達水平進行檢測。結(jié)果:mfb為α-sma表達陽性的梭形細胞,大量聚集在ornj動物模型的髓腔、死骨周圍以及增生的牙周膜中;在ornj組織中,mfb、tgf-β1、ctgf、colⅠ、colⅢ的表達均明顯高于對照組,α-sma陽性細胞數(shù)量和強度、ctgf、colⅠ、colⅢ的表達隨時間的推移而增加,但tgf-β1的表達隨時間的推移而下降。結(jié)論:同其他纖維化疾病一樣,ornj中也同樣存在著mfb的大量聚集,并且與mfb纖維化形成相關(guān)的上下游分子也呈高表達;mfb表達具有時間相關(guān)性,tgf-β1在mfb的早期轉(zhuǎn)化中可能起到關(guān)鍵作用,而晚期可能主要由ctgf誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化;提示mfb可能參與了ornj的發(fā)生過程,并具有重要作用,為ornj的纖維化理論提供了更多依據(jù)。三.mfb細胞的體外培養(yǎng)與觀察目的:進行mfb的體外培養(yǎng),以建立可進一步研究ornj纖維化機制的體外細胞學(xué)平臺。方法:使用組織塊法,取放療區(qū)域的纖維化組織進行細胞培養(yǎng),觀察細胞形態(tài)、增殖情況,以成纖維細胞為對照,用免疫熒光染色方法觀察特異性標(biāo)記物α-sma的表達情況,使利用western-blot法觀察α-sma、ctgf、colⅠ、colⅢ的表達水平;觀察mfb在tgf-β1的作用下,α-sma、colⅠ、colⅢ表達水平的變化情況。結(jié)果:原代培養(yǎng)1w后,組織塊周圍開始爬出細胞,傳代后7-10d可長滿;傳代細胞為梭形,且隨著傳代,細胞形態(tài)穩(wěn)定;實驗組細胞高表達α-sma,且ctgf、colⅠ、colⅢ的表達水平均高于對照組成纖維細胞;在tgf-β1作用下,實驗組α-sma、colⅠ、colⅢ的表達水平增高。結(jié)論:從ornj組織中可成功分離培養(yǎng)mfb細胞,體外培養(yǎng)的mfb細胞具有分泌ctgf、colⅠ、colⅢ的作用,并且tgf-β1可促進其轉(zhuǎn)化增殖和發(fā)揮纖維化作用,進一步說明mfb在ornj的纖維化過程中發(fā)揮重要作用。四.mfb體外誘導(dǎo)分化實驗?zāi)康?研究下頜骨局部的骨髓間充質(zhì)干細胞(bmscs)是否可以向mfb轉(zhuǎn)化,驗證病變局部是否存在mfb的細胞來源。方法:分離、培養(yǎng)bmscs,并對其進行鑒定,使用tgf-β1對其進行誘導(dǎo),觀察細胞增殖情況,以及α-sma、ctgf、colⅠ、colⅢ表達的變化情況。結(jié)果:經(jīng)tgf-β1誘導(dǎo)后,細胞α-sma的表達量明顯增高,且ctgf、colⅠ、colⅢ分泌量增多。結(jié)論:下頜骨局部的bmscs可以轉(zhuǎn)化為mfb,局部的bmscs是ornj中mfb的來源之一,更進一步說明頜骨局部存在mfb轉(zhuǎn)化的細胞基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：放射性頜骨骨壞死 放射誘導(dǎo)纖維化 肌成纖維細胞 發(fā)生機制 SD大鼠 下頜骨 生物學(xué)等效劑量 動物模型
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.55;R782
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-17
• 文獻回顧17-41
• 第一部分 ORNJ動物模型的建立及評估41-52
• 1 材料41-42
• 2 方法42-45
• 3 結(jié)果45-48
• 4 討論48-52
• 第二部分 MFB在ORNJ組織中表達特點的研究52-62
• 1 材料52-54
• 2 方法54-57
• 3 結(jié)果57-60
• 4 討論60-62
• 第三部分 MFB的體外培養(yǎng)與觀察62-69
• 1 材料62-63
• 2 方法63-65
• 3 結(jié)果65-67
• 4 討論67-69
• 第四部分 MFB的體外誘導(dǎo)分化實驗69-76
• 1 材料69
• 2 方法69-71
• 3 結(jié)果71-74
• 4 討論74-76
• 小結(jié)76-78
• 參考文獻78-89
• 個人簡歷和研究成果89-90
• 致謝90

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