背景杜氏肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy,DMD）是男性兒童時期最常見的致死性X連鎖隱性遺傳病,主要致病原因?yàn)镈MD基因突變,臨床上尚無有效的治療手段,主要通過糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用來延緩病情。目前DMD的治療研究重點(diǎn)已深入到基因治療水平。在外顯子51存在的情況下,通過敲除或跳躍第51外顯子,可以使13%的DMD患者變?yōu)锽MD從而延緩病情。DMD患者來源的iPSC是進(jìn)行DMD疾病研究的模型,也是治療效果評價的較好的模型,通過CRISPR/Cas9對DMD等單基因遺傳病患者來源的iPSCs進(jìn)行基因修飾,可獲得同一來源遺傳背景一致的未修飾的患病細(xì)胞及修飾過的對照組的細(xì)胞。然而在臨床上獲得適合Exon51外顯子敲除的DMD患胎來源的iPSC較為困難。通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對正常人來源的H1細(xì)胞誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞進(jìn)行基因修飾,將其變成適合Exon51外顯子敲除的突變細(xì)胞類型,然后進(jìn)行基因修飾研究是一個合理的解決辦法。本實(shí)驗(yàn)中,使用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建DMD基因Exon50缺失的H1細(xì)胞來源的成肌細(xì)胞系,并將DMD基因Exon51進(jìn)行靶向敲除,通... 

【文章來源】：鄭州大學(xué)河南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

MSC樣細(xì)胞分化流程圖

驗(yàn)結(jié)果gRNA 活性檢測序列經(jīng) Cas9/sgRNA 切割后由于缺乏修復(fù)模板，將主要以非）的方式進(jìn)行隨機(jī)修復(fù)，或多或少會插入或刪除一些堿基。因 擴(kuò)增后經(jīng)變性、退火，將形成錯配。錯配酶（主要是 CEL1 或配的雜合雙鏈并剪切。將產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，就可以通過比割條帶的比例，即可反映出 Cas/sgRNA 的活性（見圖 2）。

圖 3 A1-A4：流式細(xì)胞儀篩選后，顯微鏡下挑選綠色熒光強(qiáng)的克隆每次傳代后的白色熒光下（100×）的 H1 細(xì)胞圖片；B1-B4：白色熒光相對應(yīng)的同視野下綠色熒光圖（100×）。經(jīng)過數(shù)次挑克隆傳代，在綠色熒光顯微鏡下顯示 H1 細(xì)胞綠色熒光區(qū)域接近100%。（2）H1 敲除鑒定在篩選到可穩(wěn)定傳代的＞90%綠色熒光遺傳的 H1 細(xì)胞后，提取 H1 細(xì)胞基因組行 DMD 基因 MLPA 檢測其 Exon50 外顯子缺失情況（見圖 4）。


本文編號：2909258