基因治療(Gene therapy)是利用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將治療基因?qū)氚薪M織或靶細(xì)胞,糾正或改善異常表達(dá)的基因,恢復(fù)其正常的生物學(xué)功能,從而達(dá)到治療疾病的目的。在治療基因的選擇中,具有RNA干擾能力的microRNA(miRNA)分子由于其胞內(nèi)精準(zhǔn)靶向識別的優(yōu)勢,在重大疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色,已經(jīng)成為多種疾病基因治療的焦點(diǎn)。miRNA是一類非編碼單鏈小分子RNA,長度約21-23個核苷酸,能夠通過靶基因mRNA的降解及單純抑制翻譯過程兩條途徑來降低靶基因的表達(dá)水平。在miRNA下調(diào)或缺失所引發(fā)的疾病中,通過遞送相關(guān)的miRNA模擬物(miRNA mimics)來恢復(fù)靶組織或靶細(xì)胞中正常miRNA表達(dá)水平,實(shí)現(xiàn)與內(nèi)源miRNA相同的生物學(xué)功能,能一定程度上緩解疾病,阻止疾病的發(fā)生發(fā)展,具有較高的醫(yī)學(xué)前景。然而,小核酸自身不夠穩(wěn)定,易被血液中核酸酶降解;同時,其本身負(fù)電荷不容易被細(xì)胞攝取。因此,小核酸miRNA必須依賴高效的基因遞送系統(tǒng)才能實(shí)現(xiàn)作為基因藥物的療效,發(fā)揮其生物學(xué)功能。目前,常用的基因傳輸載體主要分為病毒類基因傳輸載體以及非病毒類基因傳輸載體。然而,病毒類載體存在嚴(yán)重的免疫原性,極大限制其在基因領(lǐng)域的應(yīng)用。相比之下,非病毒類基因傳輸載體具有更低的細(xì)胞毒性,免疫原性以及生產(chǎn)簡單的特點(diǎn),因此備受關(guān)注。在這一類載體中,樹枝狀高分子聚酰胺-胺(PAMAM)由于其獨(dú)特的性質(zhì)而得到廣泛研究,具體原因如下:首先,PAMAM最外層氨基提供高密度的陽離子電荷,可以有效結(jié)合組裝核酸分子。其次,在小核酸藥物遞送中,核酸分子與樹枝狀高分子形成穩(wěn)定復(fù)合物能保護(hù)核酸分子免受核酸酶的降解。第三,樹枝狀高分子PAMAM結(jié)構(gòu)中含有大量的三級胺,能通過“質(zhì)子海綿”效應(yīng)加快納米復(fù)合物實(shí)現(xiàn)內(nèi)涵體逃逸。此外,樹枝狀高分子的多氨基的表面適合多功能化修飾。比如:外層氨基被修飾靶向配體,能加速載體被靶器官或靶細(xì)胞胞吞過程。因此,樹枝狀高分子PAMAM的特殊的物理化學(xué)性質(zhì)使其優(yōu)于其他線性的高分子材料,在核酸類藥物遞送體系中能發(fā)揮更大的潛力。雖然如此,PAMAM的轉(zhuǎn)染效率依舊不盡如人意,其具有較高的細(xì)胞毒性更是限制其在基因遞送領(lǐng)域的應(yīng)用。因此,針對上述問題,我們利用堿基修飾及氟化修飾的手段對PAMAM表面最外層氨基進(jìn)行修飾,構(gòu)建一類高效、低毒的PAMAM衍生物遞送體系,并實(shí)現(xiàn)小核酸miRNA在體內(nèi)及胞內(nèi)的精準(zhǔn)遞送。具體研究內(nèi)容與結(jié)果如下:1.堿基修飾型樹枝狀高分子介導(dǎo)miR-23b遞送治療肺癌的研究癌癥是世界關(guān)注的公共衛(wèi)生問題,其中肺癌是最常見的惡性腫瘤之一。到目前為止,手術(shù)依舊是治療肺癌的主要手段,但術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移依舊會導(dǎo)致治療失敗。而基于小核酸miRNA基因治療手段能從基因?qū)用嫔弦种颇[瘤增殖,遷移,因此成為癌癥治療的新選擇。在本章中,利用2-氨基-6-氯嘌呤修飾PAMAM,成功構(gòu)建了堿基修飾型樹枝狀高分子AP-PAMAM。經(jīng)過修飾后的AP-PAMAM能通過氫鍵相互作用,調(diào)節(jié)與核酸分子的結(jié)合與釋放,大幅度提高了其轉(zhuǎn)染效率。此外,由于最外層氨基被屏蔽,AP-PAMAM正電荷下降,導(dǎo)致其細(xì)胞毒性也隨之下降。接著,以AP-PAMAM作為基因載體,成功的實(shí)現(xiàn)了miR-23b在肺癌細(xì)胞A549的遞送,并通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及周期阻滯,有效的抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。經(jīng)過納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染后,miR-23b在腫瘤細(xì)胞內(nèi)同時激活線粒體依賴的凋亡途徑以及死亡受體依賴的凋亡途徑,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。不僅如此,miR-23b的胞內(nèi)遞送還能降低致癌蛋白Bcl-2和Survivin的表達(dá)同時提高抑癌蛋白PTEN水平。除了誘導(dǎo)凋亡以外,miR-23b還能下調(diào)Cyclin D1的表達(dá),導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞阻滯在S期。與此同時,經(jīng)過小核酸miR-23b遞送后,與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白MMP-9表達(dá)量明顯被抑制,因此產(chǎn)生了抗腫瘤遷移和浸潤的能力�？傊�,堿基修飾型PAMAM載體介導(dǎo)miR-23b遞送有望成為腫瘤基因治療的新的手段。2.氟化修飾型樹枝狀高分子介導(dǎo)miR-23b遞送治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中,過度的炎癥因子釋放以及炎癥患處缺乏必要的細(xì)胞凋亡能加劇疾病的惡化。因此,針對凋亡及炎癥反應(yīng)設(shè)計miRNA遞送系統(tǒng)有望緩解并治療這一疾病。在這一章中,我們通過氟化修飾方法構(gòu)建了氟化修飾型PAMAM載體FP,進(jìn)行miR-23b的高效遞送。以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7為模型,FP/miR-23b能有效激活線粒體凋亡途徑來誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡。與此同時,miR-23b還通過靶向IKK-α,TAB2以及TAB3,來抑制NF-κB信號通路網(wǎng)絡(luò),從而降低促炎癥因子TNF-α,IL-1β和IL-6的表達(dá)。由此說明,miR-23b可以通過抗炎及抗增殖的協(xié)同效應(yīng),實(shí)現(xiàn)抑制炎癥的根本目的,為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療提供理論基礎(chǔ)。隨后,利用佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠模型來評價FP/miR-23b納米復(fù)合物的治療效果。經(jīng)過治療后,納米復(fù)合物能通過ELVIS效應(yīng)滯留在患病關(guān)節(jié)處,從而提高關(guān)節(jié)內(nèi)miR-23b的表達(dá)量。不僅如此,在經(jīng)過治療的關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)內(nèi),滑膜組織浸潤的現(xiàn)象得到明顯抑制,患病關(guān)節(jié)及血清內(nèi)的促炎因子的表達(dá)量都下降或恢復(fù)到正常水平,體現(xiàn)了FP/miR-23b納米復(fù)合物具有減緩炎癥,抑制骨組織侵蝕,并改善大鼠運(yùn)動能力的治療效果。最后,在正常大鼠體內(nèi),FP/miR-23b納米復(fù)合物并未表現(xiàn)出明顯的腎臟及肝臟毒性,說明其具有良好的生物相容性,有利于臨床開發(fā)及應(yīng)用。以上結(jié)果說明,氟化修飾型PAMAM介導(dǎo)的小核酸遞送能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及抑制炎癥反應(yīng)的協(xié)同效應(yīng)來實(shí)現(xiàn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療,為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及其他自身免疫疾病的基因治療的提供了新的啟示。綜上,我們構(gòu)建了一類高效低毒的小核酸遞送載體,能有效幫助小核酸遞送至不同疾病模型中,并精準(zhǔn)識別胞內(nèi)靶點(diǎn),發(fā)揮其治療功能,為基于小核酸所構(gòu)建的重大疾病納米藥物設(shè)計與評價提供了新的思路。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R450
【部分圖文】：

基因治療發(fā)展史概況[9]

圖 1.3 miRNA 的產(chǎn)生及 RNA 干擾的機(jī)理越來越多的研究報道了 miRNA 異常表達(dá)與疾病的發(fā)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病以及自身免疫性疾RNA 表達(dá)異常而開發(fā)出的基因治療對于治療疾病有著

骨和軟骨的病理損傷。關(guān)節(jié)骨和軟骨的連接處，往往會形RA 中另一個重要的病理現(xiàn)象，也是要特征之一（圖 1.5）[90]。血管翳的軟組織，導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形，最終功增生往往伴隨著新生血管的形成，，同時也促進(jìn)了血管翳的生成和維透性增強(qiáng)，產(chǎn)生了類似腫瘤組織血（ extravasation through leaky vasiated sequestration，ELVIS）（圖 1、脂質(zhì)體、膠束等納米給藥系統(tǒng)，釋放藥物而發(fā)揮靶向和長效治療作
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