乳腺癌作為一種女性常見的惡性腫瘤,它的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢,隨著人們對放療這一治療方法認知的不斷深入,還有放療技術的不斷提高改善以及放療的適應范圍越來越廣,目前放射治療已經(jīng)成為乳腺癌的主要治療手段之一。自噬是細胞內(nèi)的一種清除受損衰老的蛋白質(zhì)或細胞器的自我消化的過程,近年來自噬與癌癥之間的關系成為研究熱點,自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中是把雙刃劍,既可能在缺氧或饑餓時起到保護細胞的作用,也可能發(fā)生自噬性細胞死亡。Bcl-2和腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3(BNIP3)是Bcl-2家族蛋白的一員,是一種包含BH3結(jié)構(gòu)域的能編碼線粒體蛋白的基因。BNIP3既能夠激活細胞凋亡也能夠激活細胞自噬,BNIP3的高表達與腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移以及預后密切相關。本研究著重討論BNIP3在電離輻射誘導乳腺癌MCF-7細胞自噬中的作用,以及關于BNIP3在自噬過程中發(fā)揮作用的相關機制的研究。目的:以人乳腺癌MCF-7細胞作為研究對象,旨在研究BNIP3在電離輻射誘導的乳腺癌細胞自噬中發(fā)揮的作用以及其可能的相關機制,為腫瘤的靶向治療提供新途徑。方法:(1)本研究選用人乳腺癌MCF-7細胞作為研究對象,使用慢病毒感染液構(gòu)建穩(wěn)定的BNIP3沉默模型(shBNIP3)和空載體(shNC)細胞;(2)照射條件:使用X-RAD 320iX深部輻照儀進行X射線照射,電壓180千伏,電流20毫安,單次源靶距70厘米,劑量率1.0 Gy/min,本實驗照射劑量8Gy;(3)使用CCK8和克隆形成實驗來檢測細胞生存率以及輻射敏感性;(4)使用Western Blot來檢測不同蛋白的表達水平,使用co-IP來檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用;(5)使用流式細胞術來檢測細胞內(nèi)自噬和活性氧的表達情況;(6)使用Western Blot和RT-PCR來檢測BNIP3沉默模型的沉默效果;(7)使用SPSS軟件來進行統(tǒng)計分析,柱狀圖使用GraphPad軟件并用均數(shù)±標準差表示,組間比較使用t檢驗,當P值小于0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:1.BNIP3參與電離輻射誘導的MCF-7細胞自噬給予MCF-7細胞8Gy電離輻射,CCK8結(jié)果顯示,與0Gy組細胞相比,8Gy照射使細胞的生存率明顯降低,并且生存率減少的趨勢呈時間依賴性;MCF-7細胞經(jīng)過8Gy照射后,分別在24h和48h兩個時間提取細胞中的總蛋白,Western Blot檢測自噬相關蛋白Beclin-1和MAPLC3及BNIP3的表達情況,結(jié)果顯示,相比于未照射組,細胞經(jīng)過8Gy照射后,Beclin-1、MAPLC3和BNIP3的表達均明顯增加,并呈現(xiàn)時間依賴性,即與照射后24h組相比,照射后48h組的三種蛋白表達量更高;活性氧能夠誘導自噬的發(fā)生,流式細胞術的結(jié)果表明,電離輻射不僅能導致MCF-7細胞的自噬增加,還能明顯增加MCF-7細胞中的ROS水平。以上結(jié)果提示電離輻射誘導ROS產(chǎn)生,增加MCF-7細胞的自噬水平,并且BNIP3參與了電離輻射誘導的MCF-7細胞自噬。2.BNIP3如何調(diào)控電離輻射誘導MCF-7細胞自噬在MCF-7細胞中構(gòu)建穩(wěn)定的BNIP3基因沉默模型,用Western Blot和RT-PCR進行沉默效果的驗證,結(jié)果顯示BNIP3沉默模型建立成功,并且shBNIP3-2的沉默效果比shBNIP3-1的沉默效果要好;給予BNIP3沉默模型8Gy的電離輻射:(1)照射后使用CCK8法檢測沉默BNIP3后細胞存活的情況,結(jié)果顯示,照射后BNIP3沉默組細胞生存率明顯高于照射后空載體組細胞的生存率,說明了沉默BNIP3能夠明顯降低電離輻射誘導的細胞死亡;(2)照射后使用克隆形成實驗檢測沉默BNIP3對于細胞輻射敏感性的影響,結(jié)果顯示,與空載體組相比,沉默BNIP3能夠明顯降低MCF-7細胞的輻射敏感性,增加細胞對于輻射的抗性;(3)照射后使用Western Blot檢測沉默BNIP3對于電離輻射誘導的細胞自噬的影響,結(jié)果顯示,與空載體組相比,BNIP3沉默模型照射后,MAPLC3-II的表達水平明顯增加,BNIP3的表達水平同樣明顯增加,說明了沉默BNIP3能夠明顯增加電離輻射誘導的細胞自噬;(4)流式細胞術的結(jié)果表明,電離輻射不僅能導致BNIP3沉默模型的自噬增加,還能明顯增加BNIP3沉默模型中的ROS水平;(5)照射后使用Western Blot檢測沉默BNIP3對于電離輻射誘導的細胞鐵代謝的影響,結(jié)果顯示,與空載體組相比,BNIP3沉默組照射后,Transferrin的表達水平明顯升高,FTH1的表達水平明顯降低,說明了BNIP3參與了鐵代謝的調(diào)節(jié),并且沉默BNIP3能夠明顯增加電離輻射誘導的細胞鐵代謝;(6)使用Western Blot來檢測線粒體膜蛋白TOM20的表達情況,沉默BNIP3后給予細胞電離輻射,TOM20的表達水平明顯增加,這說明電離輻射在BNIP3沉默模型中能夠誘導線粒體自噬,并且沉默BNIP3能夠增加電離輻射誘導的線粒體自噬。3.MAPLC3與BNIP3介導的線粒體自噬之間的關系自噬通量(autophagy flux)的分析是反映自噬活性的可靠指標,它的檢測方法通常是在細胞中加入一定濃度的NH_4Cl進行處理后檢測MAPLC3-II表達量的變化情況。在BNIP3沉默模型中加入30mM濃度的NH_4Cl預處理1h后進行0Gy或8Gy劑量的照射,照射后48h使用CCK8法檢測NH_4Cl對于電離輻射誘導BNIP3沉默模型中細胞死亡的影響情況,結(jié)果顯示,加入NH_4Cl處理并8Gy照射的BNIP3沉默組細胞的生存率明顯高于空載體組細胞,這表明NH_4Cl能夠抑制電離輻射誘導的BNIP3沉默模型的細胞死亡;在BNIP3沉默模型中加入30mM濃度的NH_4Cl預處理1h后進行0Gy或8Gy劑量的照射,照射后48h使用Western Blot檢測BNIP3和MAPLC3蛋白的表達情況,結(jié)果顯示,加入NH_4Cl處理并8Gy照射的BNIP3沉默組細胞中BNIP3和MAPLC3蛋白的表達均明顯高于空載體組細胞,以上結(jié)果提示NH_4Cl能夠明顯增加BNIP3和MAPLC3的表達,NH_4Cl的加入起到了自噬放大信號的作用,并且能夠增加電離輻射誘導的BNIP3沉默模型中的自噬。給予BNIP3沉默模型8Gy電離輻射,照射后48h提取細胞中的總蛋白,通過免疫共沉淀(co-IP)檢測BNIP3與MAPLC3之間的結(jié)合作用。Co-IP的結(jié)果提示,BNIP3通過與自噬相關蛋白MAPLC3相互結(jié)合來調(diào)控線粒體自噬,并且電離輻射能夠增加BNIP3與MAPLC3的相互作用。結(jié)論:1.BNIP3能夠增加電離輻射誘導的MCF-7細胞自噬。2.BNIP3能夠增加電離輻射誘導的ROS表達水平。3.BNIP3能夠增加電離輻射誘導的細胞鐵代謝異常。4.BNIP3介導的是線粒體自噬。5.IR通過增強BNIP3與MAPLC3之間的相互作用來增加線粒體自噬。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R737.9;R730.55
【部分圖文】：

圖 1.1 線粒體選擇性自噬性降解的過程癌與細胞自噬作為一種女性常見的惡性腫瘤，它具有發(fā)病率高、潛伏期特點，并且呈年輕化趨勢[10]。乳腺癌的治療與癌細胞的凋噬之間的關系復雜，自噬可能促進細胞凋亡亦可能抑制細發(fā)生發(fā)展中是自噬和凋亡共同調(diào)控癌細胞的過程[11]。許多

Matsushima 等人從胎盤 cDNA 庫中分離出的一種 cDNA，它能夠編碼一種含有 219 個氨基酸的蛋白，其序列與 BNIP3 具有 65％同源性，因此命名為 BNIP3-like(BNIP3L)[51]或 Nip-like 蛋白 X(Nix)[52]。BNIP3L 基因定位于染色體 8p21[53]。BNIP3L 的 BH3 結(jié)構(gòu)域和 TM 結(jié)構(gòu)域定位于兩個蛋白質(zhì)之間同源性最高的區(qū)域(見圖 2)，另外 BNIP3L 基因還含有 PEST 序列[54]。BNIP3L 與BNIP3 具有相近的促凋亡作用，但是在促自噬時二者有所差別：當細胞處于穩(wěn)態(tài)或是受到輕微刺激時，二者均可以激活促細胞存活的自噬；但是當細胞處于應激狀態(tài)時，BNIP3 誘導的線粒體自噬最終會導致細胞死亡，而 BNIP3L 并不能過度誘導線粒體自噬[55]。

第 3 章 實驗結(jié)果IP3 參與電離輻射誘導的 MCF-7 細胞自噬輻射降低 MCF-7 細胞存活率究電離輻射對于人乳腺癌 MCF-7 細胞死亡的影響，給予離輻射，照射后 24h 和 48h 使用 CCK8 法檢測細胞存活情值標準化為 1。結(jié)果顯示，相比于未照射組，細胞經(jīng)過 8G明顯降低，并且隨著照射后時間的延長，細胞生存率減少。這表明電離輻射能夠降低 MCF-7 細胞的生存率，促進 3.1）。
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本文編號：2889794