乳腺癌作為一種女性常見的惡性腫瘤,它的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì),隨著人們對(duì)放療這一治療方法認(rèn)知的不斷深入,還有放療技術(shù)的不斷提高改善以及放療的適應(yīng)范圍越來越廣,目前放射治療已經(jīng)成為乳腺癌的主要治療手段之一。自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種清除受損衰老的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器的自我消化的過程,近年來自噬與癌癥之間的關(guān)系成為研究熱點(diǎn),自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中是把雙刃劍,既可能在缺氧或饑餓時(shí)起到保護(hù)細(xì)胞的作用,也可能發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡。Bcl-2和腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3(BNIP3)是Bcl-2家族蛋白的一員,是一種包含BH3結(jié)構(gòu)域的能編碼線粒體蛋白的基因。BNIP3既能夠激活細(xì)胞凋亡也能夠激活細(xì)胞自噬,BNIP3的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)。本研究著重討論BNIP3在電離輻射誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞自噬中的作用,以及關(guān)于BNIP3在自噬過程中發(fā)揮作用的相關(guān)機(jī)制的研究。目的:以人乳腺癌MCF-7細(xì)胞作為研究對(duì)象,旨在研究BNIP3在電離輻射誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞自噬中發(fā)揮的作用以及其可能的相關(guān)機(jī)制,為腫瘤的靶向治療提供新途徑。方法:(1)本研究選用人乳腺癌MCF-7細(xì)胞作為研究對(duì)象,使用慢病毒感染液構(gòu)建穩(wěn)定的BNIP3沉默模型(shBNIP3)和空載體(shNC)細(xì)胞;(2)照射條件:使用X-RAD 320iX深部輻照儀進(jìn)行X射線照射,電壓180千伏,電流20毫安,單次源靶距70厘米,劑量率1.0 Gy/min,本實(shí)驗(yàn)照射劑量8Gy;(3)使用CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)細(xì)胞生存率以及輻射敏感性;(4)使用Western Blot來檢測(cè)不同蛋白的表達(dá)水平,使用co-IP來檢測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用;(5)使用流式細(xì)胞術(shù)來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬和活性氧的表達(dá)情況;(6)使用Western Blot和RT-PCR來檢測(cè)BNIP3沉默模型的沉默效果;(7)使用SPSS軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,柱狀圖使用GraphPad軟件并用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較使用t檢驗(yàn),當(dāng)P值小于0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.BNIP3參與電離輻射誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞自噬給予MCF-7細(xì)胞8Gy電離輻射,CCK8結(jié)果顯示,與0Gy組細(xì)胞相比,8Gy照射使細(xì)胞的生存率明顯降低,并且生存率減少的趨勢(shì)呈時(shí)間依賴性;MCF-7細(xì)胞經(jīng)過8Gy照射后,分別在24h和48h兩個(gè)時(shí)間提取細(xì)胞中的總蛋白,Western Blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和MAPLC3及BNIP3的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,相比于未照射組,細(xì)胞經(jīng)過8Gy照射后,Beclin-1、MAPLC3和BNIP3的表達(dá)均明顯增加,并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性,即與照射后24h組相比,照射后48h組的三種蛋白表達(dá)量更高;活性氧能夠誘導(dǎo)自噬的發(fā)生,流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果表明,電離輻射不僅能導(dǎo)致MCF-7細(xì)胞的自噬增加,還能明顯增加MCF-7細(xì)胞中的ROS水平。以上結(jié)果提示電離輻射誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生,增加MCF-7細(xì)胞的自噬水平,并且BNIP3參與了電離輻射誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞自噬。2.BNIP3如何調(diào)控電離輻射誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞自噬在MCF-7細(xì)胞中構(gòu)建穩(wěn)定的BNIP3基因沉默模型,用Western Blot和RT-PCR進(jìn)行沉默效果的驗(yàn)證,結(jié)果顯示BNIP3沉默模型建立成功,并且shBNIP3-2的沉默效果比shBNIP3-1的沉默效果要好;給予BNIP3沉默模型8Gy的電離輻射:(1)照射后使用CCK8法檢測(cè)沉默BNIP3后細(xì)胞存活的情況,結(jié)果顯示,照射后BNIP3沉默組細(xì)胞生存率明顯高于照射后空載體組細(xì)胞的生存率,說明了沉默BNIP3能夠明顯降低電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡;(2)照射后使用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默BNIP3對(duì)于細(xì)胞輻射敏感性的影響,結(jié)果顯示,與空載體組相比,沉默BNIP3能夠明顯降低MCF-7細(xì)胞的輻射敏感性,增加細(xì)胞對(duì)于輻射的抗性;(3)照射后使用Western Blot檢測(cè)沉默BNIP3對(duì)于電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬的影響,結(jié)果顯示,與空載體組相比,BNIP3沉默模型照射后,MAPLC3-II的表達(dá)水平明顯增加,BNIP3的表達(dá)水平同樣明顯增加,說明了沉默BNIP3能夠明顯增加電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬;(4)流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果表明,電離輻射不僅能導(dǎo)致BNIP3沉默模型的自噬增加,還能明顯增加BNIP3沉默模型中的ROS水平;(5)照射后使用Western Blot檢測(cè)沉默BNIP3對(duì)于電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵代謝的影響,結(jié)果顯示,與空載體組相比,BNIP3沉默組照射后,Transferrin的表達(dá)水平明顯升高,FTH1的表達(dá)水平明顯降低,說明了BNIP3參與了鐵代謝的調(diào)節(jié),并且沉默BNIP3能夠明顯增加電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵代謝;(6)使用Western Blot來檢測(cè)線粒體膜蛋白TOM20的表達(dá)情況,沉默BNIP3后給予細(xì)胞電離輻射,TOM20的表達(dá)水平明顯增加,這說明電離輻射在BNIP3沉默模型中能夠誘導(dǎo)線粒體自噬,并且沉默BNIP3能夠增加電離輻射誘導(dǎo)的線粒體自噬。3.MAPLC3與BNIP3介導(dǎo)的線粒體自噬之間的關(guān)系自噬通量(autophagy flux)的分析是反映自噬活性的可靠指標(biāo),它的檢測(cè)方法通常是在細(xì)胞中加入一定濃度的NH_4Cl進(jìn)行處理后檢測(cè)MAPLC3-II表達(dá)量的變化情況。在BNIP3沉默模型中加入30mM濃度的NH_4Cl預(yù)處理1h后進(jìn)行0Gy或8Gy劑量的照射,照射后48h使用CCK8法檢測(cè)NH_4Cl對(duì)于電離輻射誘導(dǎo)BNIP3沉默模型中細(xì)胞死亡的影響情況,結(jié)果顯示,加入NH_4Cl處理并8Gy照射的BNIP3沉默組細(xì)胞的生存率明顯高于空載體組細(xì)胞,這表明NH_4Cl能夠抑制電離輻射誘導(dǎo)的BNIP3沉默模型的細(xì)胞死亡;在BNIP3沉默模型中加入30mM濃度的NH_4Cl預(yù)處理1h后進(jìn)行0Gy或8Gy劑量的照射,照射后48h使用Western Blot檢測(cè)BNIP3和MAPLC3蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,加入NH_4Cl處理并8Gy照射的BNIP3沉默組細(xì)胞中BNIP3和MAPLC3蛋白的表達(dá)均明顯高于空載體組細(xì)胞,以上結(jié)果提示NH_4Cl能夠明顯增加BNIP3和MAPLC3的表達(dá),NH_4Cl的加入起到了自噬放大信號(hào)的作用,并且能夠增加電離輻射誘導(dǎo)的BNIP3沉默模型中的自噬。給予BNIP3沉默模型8Gy電離輻射,照射后48h提取細(xì)胞中的總蛋白,通過免疫共沉淀(co-IP)檢測(cè)BNIP3與MAPLC3之間的結(jié)合作用。Co-IP的結(jié)果提示,BNIP3通過與自噬相關(guān)蛋白MAPLC3相互結(jié)合來調(diào)控線粒體自噬,并且電離輻射能夠增加BNIP3與MAPLC3的相互作用。結(jié)論:1.BNIP3能夠增加電離輻射誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞自噬。2.BNIP3能夠增加電離輻射誘導(dǎo)的ROS表達(dá)水平。3.BNIP3能夠增加電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵代謝異常。4.BNIP3介導(dǎo)的是線粒體自噬。5.IR通過增強(qiáng)BNIP3與MAPLC3之間的相互作用來增加線粒體自噬。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.9;R730.55
【部分圖文】：
圖 1.1 線粒體選擇性自噬性降解的過程癌與細(xì)胞自噬作為一種女性常見的惡性腫瘤，它具有發(fā)病率高、潛伏期特點(diǎn)，并且呈年輕化趨勢(shì)[10]。乳腺癌的治療與癌細(xì)胞的凋噬之間的關(guān)系復(fù)雜，自噬可能促進(jìn)細(xì)胞凋亡亦可能抑制細(xì)發(fā)生發(fā)展中是自噬和凋亡共同調(diào)控癌細(xì)胞的過程[11]。許多
Matsushima 等人從胎盤 cDNA 庫中分離出的一種 cDNA，它能夠編碼一種含有 219 個(gè)氨基酸的蛋白，其序列與 BNIP3 具有 65％同源性，因此命名為 BNIP3-like(BNIP3L)[51]或 Nip-like 蛋白 X(Nix)[52]。BNIP3L 基因定位于染色體 8p21[53]。BNIP3L 的 BH3 結(jié)構(gòu)域和 TM 結(jié)構(gòu)域定位于兩個(gè)蛋白質(zhì)之間同源性最高的區(qū)域(見圖 2)，另外 BNIP3L 基因還含有 PEST 序列[54]。BNIP3L 與BNIP3 具有相近的促凋亡作用，但是在促自噬時(shí)二者有所差別：當(dāng)細(xì)胞處于穩(wěn)態(tài)或是受到輕微刺激時(shí)，二者均可以激活促細(xì)胞存活的自噬；但是當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，BNIP3 誘導(dǎo)的線粒體自噬最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而 BNIP3L 并不能過度誘導(dǎo)線粒體自噬[55]。
第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果IP3 參與電離輻射誘導(dǎo)的 MCF-7 細(xì)胞自噬輻射降低 MCF-7 細(xì)胞存活率究電離輻射對(duì)于人乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞死亡的影響，給予離輻射，照射后 24h 和 48h 使用 CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞存活情值標(biāo)準(zhǔn)化為 1。結(jié)果顯示，相比于未照射組，細(xì)胞經(jīng)過 8G明顯降低，并且隨著照射后時(shí)間的延長，細(xì)胞生存率減少。這表明電離輻射能夠降低 MCF-7 細(xì)胞的生存率，促進(jìn) 3.1）。
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本文編號(hào)：
2889794
