目的:鑒定γ射線照射后肺上皮細(xì)胞中miRNAs的差異表達(dá)譜,獲取輻射致差異表達(dá)miRNAs的生物學(xué)信息;研究電離輻射致差異表達(dá)的miRNAs在輻射誘導(dǎo)肺上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及其相關(guān)機(jī)制。方法:用20 Gy的~(60)Coγ射線單次全胸部照射C57BL/6小鼠,繼續(xù)飼養(yǎng)14 d后,取肺組織提蛋白用于Western blot檢測,觀察E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Twist等蛋白的變化;分析miRNA芯片結(jié)果以鑒定照射后肺細(xì)胞中miRNAs的差異表達(dá)譜。~(60)Coγ射線6 Gy照射A549細(xì)胞和BEAS-2B細(xì)胞,48 hr后,用倒置顯微鏡觀測細(xì)胞形態(tài),用Western blot技術(shù)鑒定EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)。Real-Time PCR方法驗(yàn)證部分顯著性差異表達(dá)的miRNAs,通過TargetScan、miRDB和microT-CDS預(yù)測差異miRNAs的靶基因,DAVID、KEGG和DIANA等在線工具進(jìn)行生物信息學(xué)分析,結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研進(jìn)行預(yù)測分析。通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)結(jié)合miRNA模擬物和miRNA抑制劑,在A549和BEAS-2B細(xì)胞中進(jìn)行功能獲得性/缺失性實(shí)驗(yàn),探究miRNAs在IR誘導(dǎo)的EMT中的作用。通過生物信息學(xué)、RT-qPCR、Western blot和雙熒光素酶報(bào)告基因等技術(shù)確定miRNAs在IR誘導(dǎo)的EMT中起作用的靶基因。使用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Twist等蛋白的熒光強(qiáng)弱,以此來輔助Western blot結(jié)果。通過RT-qPCR和Western blot技術(shù)檢測miRNA靶基因的下游通路蛋白的表達(dá)變化和活化情況,進(jìn)一步探討miRNA介導(dǎo)IR誘導(dǎo)的EMT的相關(guān)機(jī)制。結(jié)果:用20 Gy的~(60)Coγ射線單次全胸部照射C57BL/6小鼠,14 d后小鼠肺組織內(nèi)發(fā)生EMT。用6 Gy的~(60)Coγ射線照射的細(xì)胞,48 hr后細(xì)胞形態(tài)已從上皮樣轉(zhuǎn)變成間充質(zhì)樣,且E-cadherin表達(dá)減少,N-cadherin、Vimentin和α-SMA表達(dá)增多。小鼠肺組織miRNA芯片結(jié)果分析得到10個差異成熟mmu-miRNA,其中5個上調(diào),5個下調(diào),通過物種保守性分析類推到hsa-miRNA有7個,上調(diào)的有hsa-miR-193a-3p,hsa-miR-150-5p,hsa-miR-362-3p和hsa-miR-21-5p,下調(diào)的有hsa-miR-541-5p,hsa-miR-486-3p和hsa-miR-34a-5p,Real-Time PCR方法驗(yàn)證到這7個miRNA在照射后的A549和BEAS-2B中的表達(dá)變化與芯片結(jié)果一致,P0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miRNAs靶基因并集顯著性KEGG通路富集到與EMT相關(guān)的通路有ErbB信號通路、TGF-β信號通路、MAPK信號通路、Wnt信號通路和PI3K-Akt信號通路,表明這7個miRNA可能是IR誘導(dǎo)EMT的潛在調(diào)節(jié)分子。miRNA芯片分析發(fā)現(xiàn)miR-21的表達(dá)在受照射的肺組織中上調(diào)。我們發(fā)現(xiàn)miR-21的過表達(dá)顯著促進(jìn)纖維化EMT,miR-21的下調(diào)阻止了IR誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞纖維化EMT。證實(shí)PTEN是照射后miR-21的直接靶標(biāo)。miR-21模擬物顯著誘導(dǎo)p-Akt,抗miR-21顯著抑制IR介導(dǎo)的PTEN水平的降低和Akt磷酸化的增加;在A549和BEAS-2B細(xì)胞中證實(shí)了輻射后miR-34a-5p和miR-541-5p的表達(dá)均下調(diào)。抑制miR-34a-5p能顯著促進(jìn)EMT,miR-34a-5p過表達(dá)抑制IR誘導(dǎo)的EMT。證實(shí)miR-34a-5p靶向調(diào)控的CD44和SNAI1在照射后的肺上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),參與IR誘導(dǎo)的EMT;抑制miR-541-5p能顯著促進(jìn)EMT,miR-541-5p過表達(dá)抑制IR誘導(dǎo)的EMT。證實(shí)miR-541-5p靶向調(diào)控的SMAD2、SNAI2和COL1A2在照射后的肺上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),參與IR誘導(dǎo)的EMT。結(jié)論:1.在肺上皮細(xì)胞中,IR能上調(diào)miR-193a-3p、miR-150-5p、miR-362-3p和miR-21-5p的表達(dá),下調(diào)miR-541-5p、miR-486-3p和miR-34a-5p的表達(dá);2.IR誘導(dǎo)的miR-21通過miR-21/PTEN/Akt途徑促進(jìn)IR誘導(dǎo)的肺纖維化EMT;3.miR-34a-5p可能通過沉默CD44和SNAI1抑制IR誘導(dǎo)肺上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和RIPF;4.miR-541-5p可能通過沉默SMAD2、SNAI2和COL1A2抑制IR誘導(dǎo)肺上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和RIPF。
【學(xué)位單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R730.55
【部分圖文】：

化初始階段的主要啟動因素[28, 29]。在纖維化組織中 36%的新增成纖維細(xì)胞來自原位上皮細(xì)胞的 EMT[30]。并且在 IPF 患者肺組織和纖維化動物肺組織中發(fā)現(xiàn)，約 5%-20%的細(xì)胞發(fā)生 EMT[31]。1.3 參與 EMT 的信號通路許多信號通路可以誘導(dǎo) EMT 發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致肺纖維化，如 TGF-β 信號通路、PI3K-AKT 信號通路、Hedgehog 信號通路、Wnt/β-catenin 信號通路、EGFR 信號通路、MAPK 信號通路、Nocth 信號通路及 NF-κB 信號通路[32-34]（圖 1.1）[26]。這些信號通路能夠激活 EMT 轉(zhuǎn)錄因子如 LEF，Snail，Slug，F(xiàn)OX1/2，ZEB1/2和 Twist，從而抑制上皮標(biāo)志物基因的表達(dá)并激活 EMT[35]。其中 Twist 是一種基本的轉(zhuǎn)錄因子，能夠作為轉(zhuǎn)錄激活劑來增強(qiáng) N-cadherin 的表達(dá)，誘發(fā) EMT 的能力很強(qiáng)[36]，Twist 也可以顯著影響 Akt 信號通路的活性[37]，有學(xué)者認(rèn)為 Akt 和Twist 形成了一種正反饋調(diào)節(jié)，從而引起了一系列促進(jìn) EMT 功能的事件發(fā)生[22]。

因子[46]。MiRNA 普遍存在于大多數(shù)真核生物中，其產(chǎn)生到形成活性 RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex, RISC）的過程涉及許多酶的切割[38]。具體過程如下[47]：首先，在細(xì)胞核中 RNA 聚合酶 II 轉(zhuǎn)錄 miRNA 相關(guān)基因形成初級 miRNA（pri-miRNA），pri-miRNA 有上千個核苷酸，包含 5’ 帽結(jié)構(gòu)和 3’多聚（A）尾。然后，通過核糖核酸酶 III Drosha 加工該初級產(chǎn)物，生成釋放長度約為 70-80 個核苷酸的 miRNA 前體（pre-miRNA），呈現(xiàn) RNA 發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)[43]。之后，pre-miRNA 通過核膜上的 Exportin-5 主動輸出到細(xì)胞質(zhì)中，在胞質(zhì)中被 Dicer復(fù)合物切割，去除環(huán)區(qū)域并提供通常為 22 個左右核苷酸的成熟雙鏈 miRNA，其中一條 RNA 鏈與 argonaute 蛋白（AGO）結(jié)合，產(chǎn)生特異性結(jié)合 mRNA 靶 3’端非翻譯區(qū)（3’UTR）的 miRNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（miRISC）[48]。成熟的單鏈miRNA 通過與 mRNA 的 3’UTR 完全互補(bǔ)的方式降解靶 mRNA，而部分互補(bǔ)則導(dǎo)致 mRNA 去除或翻譯受損表達(dá)減少[42, 49-51]。

照射 C57BL/6 小鼠可誘導(dǎo)肺上皮間o γ 射線單次局部（胸部）照射 C肺上皮細(xì)胞發(fā)生 EMT 是肺纖維化60Co γ 射線胸部照射小鼠后 14 天組 C57BL/6 小鼠用60Co γ 射線 2常規(guī)飼養(yǎng) 14 天后，脫頸處死小鼠取測電離輻射對小鼠肺組織細(xì)胞中 E對照組相比較，60Co γ 射線 20 Gy達(dá)量明顯減少，間質(zhì)標(biāo)志 N-cadhe 的轉(zhuǎn)錄因子 Twist 的表達(dá)量也明顯生 EMT。
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