研究背景國際疼痛研究協(xié)會(huì)(International Association for the Study of Pain,IASP)將疼痛定義為,“一種不愉快的感覺和情緒體驗(yàn),往往伴隨有實(shí)際的或潛在的組織傷害[1]”。神經(jīng)病理性疼痛是臨床上常見的慢性頑固性疼痛綜合征,患者約占全球人口的7%-10%[2,3]。由于神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且缺乏明確的分子機(jī)制,是臨床治療中的一大挑戰(zhàn)。電壓門控鈉離子通道(Nav1.1-Nav1.9,Navx)包括河豚毒素敏感型(tetrodotoxin-sensitive,TTX-S)和河豚毒素耐受型(tetrodotoxin-resistant,TTX-R)鈉離子通道,參與動(dòng)作電位的產(chǎn)生和傳導(dǎo),與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和維持有緊密的聯(lián)系[4]。Nav1.3是TTX-S鈉離子通道亞型,由SCN3A基因編碼,位于2號(hào)染色體[5]。SCN3A在胚胎和新生兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)高表達(dá),成年以后表達(dá)量很少,但當(dāng)外周損傷或中樞神經(jīng)損傷時(shí),其表達(dá)量明顯升高[5],神經(jīng)病理性疼痛與SCN3A表達(dá)異常有關(guān)[6]。研究發(fā)現(xiàn)外周神經(jīng)損傷時(shí)Nav1.3在背根神經(jīng)節(jié)(doral root ganglion,DRG)高表達(dá)[7,8];Hains等在脊髓損傷模型(spinal cord injury,SCI)發(fā)現(xiàn)Nav1.3在脊髓背角神經(jīng)元(spinal dorsal horn neurons,SDH)表達(dá)上調(diào)[9,10]。另有研究表明鞘內(nèi)注射Nav1.3特異性反義核苷酸能夠抑制Nav1.3的表達(dá),緩解機(jī)械痛和熱痛[11]。綜上,Nav1.3可能在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和維持中扮演重要角色。盡管Nav1.3參與神經(jīng)病理性疼痛的相關(guān)機(jī)制已被報(bào)道,然而Nav1.3表達(dá)改變的具體機(jī)制仍不明確。非編碼RNA(Non-coding RNA,NcRNA)調(diào)控蛋白質(zhì)的表達(dá)成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。MicroRNAs(miRNAs)家族是一類內(nèi)源性的非編碼小RNA分子,通過與靶基因3’UTR的完全或不完全配對,降解靶基因mRNA或抑制其翻譯蛋白,在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[12,13]。MiRNAs廣泛存在于體內(nèi),在病理狀態(tài),miRNAs表達(dá)異常,可能是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)[14]。近年來,隨著研究的不斷深入,miRNAs在神經(jīng)病理性疼痛的作用受到越來越多的關(guān)注,逐漸成為鎮(zhèn)痛治療的一個(gè)新方向。利用生物信息學(xué)軟件(Target Scan Human 7.1)預(yù)測,發(fā)現(xiàn)miR-30b與SCN3A高度相關(guān)。由此,我們提出假說:在正常生理狀態(tài)下,mi R-30b能夠抑制SCN3A由mRNA到Nav1.3蛋白的翻譯,使Nav1.3保持穩(wěn)態(tài);在外周神經(jīng)受到損傷時(shí),miR-30b表達(dá)下調(diào)從而減少對SCN3A mRNA的抑制,Nav1.3表達(dá)增加,引起神經(jīng)元興奮性增強(qiáng),從而誘發(fā)神經(jīng)病理性疼痛。研究目的本實(shí)驗(yàn)利用脊神經(jīng)損傷(spinal nerve ligation,SNL),建立大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型,檢測疼痛狀態(tài)下miR-30b和Nav1.3的表達(dá)變化;通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-30b和SCN3A的靶標(biāo)關(guān)系;在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),過表達(dá)或抑制miR-30b的表達(dá),檢測Nav1.3 mRNA和蛋白水平的變化,同時(shí)檢測大鼠痛閾變化,驗(yàn)證解說。實(shí)驗(yàn)探索內(nèi)源性miR-30b對Nav1.3表達(dá)的調(diào)控機(jī)制,以期在分子水平上闡明神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生和維持的具體機(jī)制,為其臨床治療提供理論依據(jù)。研究方法(1)生物信息學(xué)軟件預(yù)測與大鼠SCN3A基因相關(guān)的miRNAs。利用生物信息學(xué)軟件Target Scan Human 7.1預(yù)測與大鼠SCN3A基因相關(guān)的miRNAs。(2)制作并鑒定SNL動(dòng)物模型。將動(dòng)物分為兩組:sham組和SNL組。SNL組大鼠鈍性分離左側(cè)棘突至骶骨的椎旁肌肉,充分暴露L4-6椎體側(cè)緣和L5脊神經(jīng),用3-0絲線結(jié)扎L5脊神經(jīng)。sham組大鼠分離左側(cè)L5脊神經(jīng)并使其保留完整,其他操作與SNL組一致。通過50%機(jī)械縮足閾值(PWTs)和熱縮足潛伏期(PWLs)的檢測,觀察行為學(xué)改變,鑒定模型是否成功;qRT-PCR,western-blot法檢測Nav1.3 mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化;免疫熒光,原位雜交法檢測DRG神經(jīng)元和脊髓Nav1.3和miR-30b的表達(dá)分布和共標(biāo)情況。(3)雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測miR-30b與SCN3A是否有靶標(biāo)關(guān)系。構(gòu)建包含SCN3A 3'UTR片段的pmirGLO雙熒光素酶載體,在PC12細(xì)胞利用轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染不同劑量的miR-30b類似物miRNA mimic,agomir 10 pM,50 pM,100 pM(50 nmol/L)和野生型載體(0.5μg/mL),檢測各組熒光素酶活性,確定兩者靶標(biāo)關(guān)系;分別轉(zhuǎn)染野生型載體和突變型載體,同時(shí)共轉(zhuǎn)染其他的miRNAs,熒光素酶活性用螢火蟲和海腎的比值表示。(4)體外原代DRG細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染探討miR-30b與Nav1.3的調(diào)控關(guān)系。為探討miR-30b是否調(diào)控Nav1.3的表達(dá),一方面用TNF-α(100 ng/mL,2 ul)刺激原代DRG細(xì)胞,30 min后轉(zhuǎn)染mi R-30b agomir,利用qRT-PCR,western-blot法檢測miR-30b與Nav1.3的表達(dá)變化,評估m(xù)iR-30b agomir對TNF-α刺激后Nav1.3表達(dá)的影響;另一方面,在正常DRG細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-30b antagomir,檢測Nav1.3 mRNA和蛋白的表達(dá)。(5)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討miR-30b對SNL誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛的影響。SNL術(shù)后10 d鞘內(nèi)注射miR-30b agomir(20μM,10μl),連續(xù)注藥4 d,檢測50%械縮足閾值(PWTs)和熱縮足潛伏期(PWLs)的改變,觀察大鼠行為學(xué)變化,評估m(xù)iR-30b agomir的鎮(zhèn)痛效果;qRT-CR,western-blot法檢測給藥前后DRG和脊髓中miR-30b和Nav1.3的表達(dá)變化,探討miR-30b調(diào)控Nav1.3參與神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制;反向地,在正常大鼠鞘內(nèi)注射miR-30b antagomir(20μM,10μl)(從第1 d連續(xù)注藥4 d),檢測大鼠對機(jī)械刺激和熱刺激的敏感性,評估m(xù)iR-30b antagomir對痛行為的影響;qRT-PCR,western-blot檢測Nav1.3 mRNA和蛋白水平的變化。研究結(jié)果(1)Target Scan Human 7.1預(yù)測結(jié)果表明與SCN3A相關(guān)的miRNAs包括miR-30abcde-5p/384-5p,miR-96/182/183-5p,miR-132-3p/223-3p。(2)SNL神經(jīng)病理性疼痛制作成功,Nav1.3表達(dá)升高,miR-30b表達(dá)降低。與sham組相比,SNL術(shù)后3 d術(shù)側(cè)機(jī)械痛閾和熱痛閾明顯降低,持續(xù)到21d(***P0.0001),模型制作成功;qRT-PCR和western-blot數(shù)據(jù)表明,在SNL大鼠DRG神經(jīng)元中Nav1.3 mRNA和蛋白表達(dá)增加,miR-30b表達(dá)減少,脊髓中有類似的現(xiàn)象;熒光雙標(biāo)結(jié)果表明在DRG神經(jīng)元中Nav1.3主要表達(dá)于無髓鞘的傷害性感覺神經(jīng)元(IB4和CGRP),與有髓鞘的非傷害性神經(jīng)元標(biāo)記物NF200及膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GS沒有共標(biāo);原位雜交結(jié)果表明mi R-30b與IB4,CGRP,NF200均有共標(biāo),miR-30b與Nav1.3共標(biāo)。(3)雙熒光素酶報(bào)告基因法驗(yàn)證miR-30b與SCN3A的標(biāo)靶關(guān)系。利用Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染野生型載體pmirGLO SCN3A 3'UTR(0.5μg/mL)與不同劑量的miR-30b agomir 10 pM,50 pM,100 pM(50 nmol/L),miR-30b agomir能夠劑量依賴性抑制熒光素酶活性(***P0.0001),驗(yàn)證了miR-30b與SCN3A有靶標(biāo)關(guān)系。將野生型載體與miR-30b agomir N.C,miR-30b antagomir等mi RNAs共同轉(zhuǎn)染,熒光素酶活性沒有變化(P0.05),表明miR-30b agomir具有序列特異性;為近一步驗(yàn)證SCN3A 3'UTR的序列特異性,將突變型載體與miR-30b agomir共同轉(zhuǎn)染到PC12細(xì)胞,與預(yù)期結(jié)果一致,熒光素酶活性也沒有明顯的改變。(4)miR-30b agomir抑制原代DRG細(xì)胞Nav1.3的表達(dá)。與正常組比較,TNF-α刺激引起原代DRG細(xì)胞Nav1.3 mRNA(***P=0.0003)和蛋白水平(***P0.0001)表達(dá)增加、miR-30b表達(dá)減少(***P=0.0007);轉(zhuǎn)染miR-30b的類似物(agomir)能夠翻轉(zhuǎn)TNF-α誘導(dǎo)的Nav1.3 mRNA(#P=0.042)和蛋白水平(#P=0.0162)的高表達(dá),并緩解miR-30b表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象(###P0.0001);另外,在正常細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-30b的抑制劑(antagomir),Nav1.3mRNA和蛋白水平表達(dá)升高,miR-30b表達(dá)降低(*P=0.014)。以上結(jié)果表明miR-30b通過結(jié)合SCN3A 3'UTR調(diào)控Nav1.3的表達(dá)。(5)鞘內(nèi)注射miR-30b agomir緩解SNL誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛。SNL大鼠術(shù)后10 d開始注藥,連續(xù)4 d鞘內(nèi)注射miR-30b agomir。注藥第2d,機(jī)械痛閾和熱痛閾明顯升高,疼痛緩解;qRT-PCR結(jié)果表明,miR-30b agomir翻轉(zhuǎn)了SNL神經(jīng)損傷大鼠DRG神經(jīng)元和脊髓中SCN3A表達(dá)上調(diào)及mi R-30b表達(dá)下調(diào)的趨勢;western-blot數(shù)據(jù)顯示,miR-30b agomir翻轉(zhuǎn)了神經(jīng)損傷后Nav1.3在DRG神經(jīng)元(*P=0.0303)和脊髓(*P=0.0110)中的高表達(dá)。上述結(jié)果表明:鞘內(nèi)注射miR-30b agomir能夠緩解SNL誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛。在正常大鼠鞘內(nèi)注射miR-30b antagomir,與注射scramble miRNA大鼠相比,miR-30b antagomir注藥期間,正常大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾顯著降低,表明miR-30b antagomir誘發(fā)了痛行為;qRT-PCR和western-blot數(shù)據(jù)表明,鞘內(nèi)注射miR-30b antagomir,抑制miR-30b的表達(dá),不僅能引起Nav1.3在DRG神經(jīng)元(**P=0.0011)和脊髓中(*P=0.0344)轉(zhuǎn)錄水平的增加,還能誘發(fā)Nav1.3在DRG神經(jīng)元(*P=0.0341)和脊髓(*P=0.0309)翻譯水平的增加。研究結(jié)論體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證明,miR-30b通過結(jié)合SCN3A 3'UTR調(diào)控SCN3A的表達(dá);SNL術(shù)后DRG和脊髓中miR-30b表達(dá)減少,Nav1.3表達(dá)升高;鞘內(nèi)注射miR-30b agomir,過表達(dá)miR-30b,抑制DRG神經(jīng)元和脊髓中Nav1.3的表達(dá),緩解SNL誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛。MiR-30b和Nav1.3是參與神經(jīng)病理性疼痛的重要分子,研究miR-30b調(diào)控Nav1.3參與神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制,為神經(jīng)病理性疼痛的治療提供一個(gè)新的方向,為臨床治療和干預(yù)提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R402
【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞簡表
前言
第一章 SNL神經(jīng)病理性疼痛模型的建立，檢測疼痛狀態(tài)下miR-30b和Nav1.3 的表達(dá)變化
    引言
    1.1 材料
        1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        1.1.2 實(shí)驗(yàn)分組
        1.1.3 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1.4 耗材
    1.2 方法
        1.2.1 SNL模型的建立
        1.2.2 行為學(xué)測定
        1.2.3 qRT-PCR技術(shù)
        1.2.4 western-blot技術(shù)
        1.2.5 免疫熒光技術(shù)
        1.2.6 原位雜交技術(shù)
    1.3 數(shù)據(jù)分析
    1.4 結(jié)果
        1.4.1 miR-30b-5p與SCN3A 3'UTR緊密相關(guān)
        1.4.2 SNL神經(jīng)損傷對大鼠行為學(xué)的影響
        1.4.3 SNL神經(jīng)病理性疼痛中Nav1.3 和miR-30b的表達(dá)變化
        1.4.4 Nav1.3 在DRG神經(jīng)元和脊髓的表達(dá)分布
        1.4.5 miR-30b在DRG神經(jīng)元和脊髓的表達(dá)分布
    1.5 討論
    1.6 結(jié)論
第二章 miR-30b通過結(jié)合SCN3A 3'UTR調(diào)控Nav1.3
    引言
    2.1 材料
        2.1.1 細(xì)胞
        2.1.2 儀器
        2.1.3 耗材
    2.2 方法
        2.2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
        2.2.2 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測
        2.2.3 原代DRG細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
        2.2.4 qRT-PCR技術(shù)
        2.2.5 western-blot技術(shù)
    2.3 數(shù)據(jù)分析
    2.4 結(jié)果
        2.4.1 miR-30b靶向調(diào)控SCN3A
        2.4.2 miR-30b agomir對Nav1.3 表達(dá)的影響
        2.4.3 miR-30b antagomir對Nav1.3 表達(dá)的影響
    2.5 討論
    2.6 結(jié)論
第三章 鞘內(nèi)注射miR-30b緩解SNL誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛
    引言
    3.1 材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)分組
        3.1.3 主要儀器(見第一章
        3.1.4 主要試劑（見第一章）
        3.1.5 試劑配置（見第一章）
    3.2 方法
        3.2.1 SNL模型制作（見第一章）
        3.2.2 蛛網(wǎng)膜下腔置管
        3.2.3 行為學(xué)測定（見第一章）
        3.2.4 qRT-PCR技術(shù)（見第一章）
        3.2.5 western-blot技術(shù)（見第一章）
    3.3 數(shù)據(jù)分析
    3.4 結(jié)果
        3.4.1 鞘內(nèi)注射miR-30b agomir對SNL大鼠行為學(xué)的影響
        3.4.2 鞘內(nèi)注射miR-30b agomir，Nav1.3 和miR-30b的表達(dá)情況
        3.4.3 鞘內(nèi)注射miR-30b antagomir對正常大鼠行為的影響
        3.4.4 正常大鼠鞘內(nèi)注射miR-30b antagomir，Nav1.3 和miR-30b的表達(dá)情況
    3.5 討論
    3.6 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡歷
致謝

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