發(fā)布時間：2020-11-09 06:00

　　 缺血性腦卒中是全球主要致死性疾病之一,占全球死亡病因的5.2%。缺血性腦卒中通常是由血栓或栓子阻斷大腦動脈血流供應,引起短暫或永久的腦血流減低所致。短暫性腦血供減少或喪失會觸發(fā)腦缺氧-再灌注損傷,誘發(fā)大量活性氧/氮(reactive oxygen and/or nitrogen species,ROS/RNS 或 RONS)的產(chǎn)生。大量產(chǎn)生的RONS被認為是介導腦缺血-再灌注后神經(jīng)元損傷最主要的因子,靶向RONS的抗氧化劑也由此成為一種能保護神經(jīng)元免受RONS損傷和改善缺血性腦卒中預后的理想藥物。目前,以新型納米材料為基礎合成的抗氧化納米酶,因具有穩(wěn)定的酶樣活性、較強的抗氧化性質(zhì)、良好的生理穩(wěn)定性和較低的合成成本等優(yōu)勢引起了廣泛關注。普魯士藍是一種美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的銫和鉈中毒的解毒劑,具有良好的生物安全性。基于普魯士藍合成的納米粒因具有磁/光性能、可控的理化性質(zhì)以及多孔結(jié)構(gòu)等優(yōu)勢,已被開發(fā)為多模態(tài)顯像探針、藥物載體和光熱轉(zhuǎn)換劑等,在生物醫(yī)學研究領域受到廣泛關注。此外,普魯士藍納米粒因其具有過氧化氫酶、超氧陰離子歧化酶和過氧化物酶等多酶樣活性,可作為有效的RONS清除劑。然而,其能否起到保護神經(jīng)元、改善缺血性腦卒中等RONS相關疾病預后的作用,尚無研究報道。正電子發(fā)射計算機斷層顯像(positron emission tomography,PET)是一種無創(chuàng)的可在細胞和分子水平上在體顯示機體生物活動的新型分子影像技術。18氟-脫氧葡萄糖(18F-fluorodeoxyglucose,18F-FDG)PET成像能夠反映機體細胞水平的葡萄糖代謝情況和細胞的活性,已用于多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷和療效評估。本研究旨在通過提出綠色安全、簡單便捷的合成方法,合成新型空心普魯士藍納米酶(hollow Prussian blue nanozymes,HPBZs),并將其應用于缺血性腦卒中,從納米技術、體外細胞和活體動物水平,探究其神經(jīng)元保護作用及相關機制;同時,基于18F-FDG PET成像,活體評估HPBZs在缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)保護作用和效果,為普魯士藍納米粒的臨床轉(zhuǎn)化提供研究基礎。第一部分HPBZs合成、表征以及性能檢測本部分研究通過研發(fā)Bi3+介導的無模板空心納米粒合成方法,成功制備了HPBZs。該方法合成路徑簡單,無需復雜的預處理和苛刻的合成條件。制備的HPBZs為直徑約65 nm、大小均一、分散均勻的空心納米粒,在生理環(huán)境下能夠維持穩(wěn)定的水合動力學直徑,表現(xiàn)出良好的生物學穩(wěn)定性。此外,HPBZs具有多酶樣活性、可變的價態(tài)和較強的氧化還原性能,不僅能夠?qū)⒍拘訰OS轉(zhuǎn)化為無毒的水分子和氧氣,而且能夠有效地清除RNS。同時,空心結(jié)構(gòu)賦予HPBZs更大的比表面積,增大HPBZs與RONS接觸面積,從而提高HPBZs清除RONS的效能。本部分研究結(jié)果為HPBZs在缺血性腦卒中中清除大量產(chǎn)生的RONS從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用提供了實驗依據(jù)。第二部分HPBZs發(fā)揮細胞保護作用的體外細胞實驗研究該部分主要研究了 HPBZs在體外細胞水平的保護作用,并進一步探討其發(fā)揮細胞保護作用的機制。首先,我們建立了體外細胞氧化應激模型,結(jié)果顯示,HPBZs能夠抵抗氧化應激損傷,保護神經(jīng)元;隨后構(gòu)建了氯化鈷誘導的體外細胞缺氧模型,結(jié)果顯示HPBZs能夠降低RONS水平,調(diào)控凋亡蛋白p53和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,從而保護缺氧受損的神經(jīng)元;此外,我們還構(gòu)建了體外炎癥模型,結(jié)果表明HPBZs能夠通過減少炎癥介質(zhì)環(huán)氧合酶-2和誘導型一氧化氮合酶的表達,抑制炎癥因子IL-1β的釋放,發(fā)揮體外細胞抗炎作用。綜上所述,HPBZs可能通過減少RONS、抵抗細胞凋亡和抑制炎癥反應,從而發(fā)揮細胞保護作用。第三部分HPBZs發(fā)揮神經(jīng)保護作用的動物實驗研究該部分主要研究了 HPBZs對缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)元保護作用,并進一步探索其發(fā)揮神經(jīng)元保護作用的機制。我們采用經(jīng)典的致大鼠大腦中動脈梗阻線栓法構(gòu)建了腦缺血-再灌注損傷大鼠模型,并于腦缺血-再灌注前2天、腦缺血-再灌注后1小時、4小時或8小時側(cè)腦室注射HPBZs(40 μg/mL,10μL),結(jié)果顯示,腦缺血-再灌注前2天或缺血-再灌注后1小時側(cè)腦室注射HPBZs可顯著減少大鼠腦梗面積、改善大鼠腦缺血區(qū)葡萄糖代謝和促進大鼠神經(jīng)行為學功能恢復;進一步分子生物學實驗結(jié)果提示HPBZs可能通過降低腦內(nèi)RONS水平、抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生和抵抗神經(jīng)元凋亡,發(fā)揮神經(jīng)元保護作用以拮抗缺血誘導的神經(jīng)元損傷。同時,初步的活體生物安全性評估(包括18F-FDG PET成像、神經(jīng)行為學測試以及2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色分析)結(jié)果顯示,HPBZs具有良好的生物安全性。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R743;R817.4
【部分圖文】：

在磁攪拌的作用下使鉍離子充分溶解并與ＰＶＰ反應；同時將Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］、ＰＶＰ和??１Ｍ鹽酸在磁攪拌的作用下充分溶解；最后，將上述兩種反應溶液混合搖勻，放置??于８０°Ｃ烘箱中反應２４小時，即可獲得ＨＰＢＺｓ?（圖１．１）。ＨＰＢＺｓ合成路徑簡單，??無需復雜苛刻的合成條件。??ｆ?ＩＷＣ＇ＮＵ＇－谷【ＦｒｔＣＮＷ＊』．Ｆ〇‘?［ＦｃｉＣＮＵ＊－Ｆｃ??醒＋ｂ－飄４?ｉ?〇??Ｂｉ．，ｐｖｐ?ｉｍｉ－ｎｗＦ－ｐｖｐ?｜??＇＇?ｘ?ＢｎＦｄＣＮＵ＇＾ＩＦｅｉＣＮｖｒ?Ｂｉ?ｈｏｌｌｏｕ?Ｐｒｕｓｓｉａｎ?ｂｌｕｅｎａｎｏｅｎｚ＞ｍｅｓ??ｉｔ?Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ?ｓｔａｔｅ?｝ｅ?Ｊ??〇?Ｂｉ！?－ＰＶＰ?＊｜Ｆｅ（ＣＭ?｜＊－ＰＶＦ＊?＿?［Ｉ?〇＜〇?Ｊ４?．ＰＶＰ?▲ｈｒ＇．－ＰＶＰ??圖１．１?ＨＰＢＺｓ合成路徑示意圖。??此外，我們發(fā)現(xiàn)，在沒有添加Ｂｉ（Ｎ０３）３條件下，普魯士藍納米酶呈現(xiàn)實心球??型（圖１．２ａ）；而在添加Ｂｉ（Ｎ０３）３后，它們開始呈現(xiàn)空心結(jié)構(gòu)（圖１．２ｂ－ｅ），且??ＨＰＢＺｓ的空腔大小隨Ｂｉ（Ｎ０３）３的濃度變化而改變（圖１．２ｂ－ｅ）。當Ｂｉ（Ｎ０３）３增加??到０．５?ｍｍｏｌ時，ＨＰＢＺｓ直徑甚至小于１００?ｎｍ?（圖１．２?ｅ）。隨著Ｂｉ３＋的過度加入，??電感耦合等離子體質(zhì)譜檢測到的Ｆｅ：?Ｂｉ的混合摩爾比保持在１７：?１的水平。ＢＰ＋離??子在ＨＰＢＺｓ的空腔形成過程中發(fā)揮著至關重要的作用（圖１．２ｆ）。??ｍｍｍ??５??

?１?Ｍ?２?Ｍ??圖１．３多種濃度鹽酸混合下普魯士藍納米酶的透射電鏡圖。在磁攪拌下，不同濃度的鹽酸（濃度??分別為?０．０００１、０．０１、０．１、１?和?２Ｍ）與?ＰＶＰ?（５ｇ）、Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］?（３％ｍｇ）混合制備的普魯士藍??納米酶的透射電鏡圖像。??ｆｉ＾ＳＬ?°??ＨＢＢｆＢ??圖１．４?Ｇｄ＿１＋取代Ｂｉ３＋制備的普魯士藍納米酶的透射電鏡圖像。在磁攪拌下，將ＰＶＰ?（５ｇ）、??Ｇｄ（Ｎ０３）３、Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］?（３９６ｍｇ）和鹽酸溶液（１Ｍ，?４０ｍＬ）混合，得到澄瀆混合溶液，后??將盛有該溶液的小燒瓶放入８０°Ｃ的烘箱內(nèi)２４小時。隨后進行離心、蒸餾水多次洗滌，最終獲??得實心的Ｇｄ３＋－普魯士藍納米酶。??３．３?ＨＰＢＺｓ的表征??為明確所制備的ＨＰＢＺｓ的物理化學特性，我們對ＨＰＢＺｓ進行了詳細的表征。??從透射電鏡圖（圖１．５?ａ），我們觀察到，所制備的ＨＰＢＺｓ的直徑約為６５?ｎｍ，大小??均一，具有明顯的空心結(jié)構(gòu)和良好的單分散性。電子衍射圖（圖１．５?ｂ）和Ｘ線衍??射圖（圖１．６）顯示所制備的ＨＰＢＺｓ具有良好的結(jié)晶性。進一步分析Ｘ線衍射圖??（圖１．６）

納米酶的透射電鏡圖像。??ｆｉ＾ＳＬ?°??ＨＢＢｆＢ??圖１．４?Ｇｄ＿１＋取代Ｂｉ３＋制備的普魯士藍納米酶的透射電鏡圖像。在磁攪拌下，將ＰＶＰ?（５ｇ）、??Ｇｄ（Ｎ０３）３、Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］?（３９６ｍｇ）和鹽酸溶液（１Ｍ，?４０ｍＬ）混合，得到澄瀆混合溶液，后??將盛有該溶液的小燒瓶放入８０°Ｃ的烘箱內(nèi)２４小時。隨后進行離心、蒸餾水多次洗滌，最終獲??得實心的Ｇｄ３＋－普魯士藍納米酶。??３．３?ＨＰＢＺｓ的表征??為明確所制備的ＨＰＢＺｓ的物理化學特性，我們對ＨＰＢＺｓ進行了詳細的表征。??從透射電鏡圖（圖１．５?ａ），我們觀察到，所制備的ＨＰＢＺｓ的直徑約為６５?ｎｍ，大小??均一，具有明顯的空心結(jié)構(gòu)和良好的單分散性。電子衍射圖（圖１．５?ｂ）和Ｘ線衍??射圖（圖１．６）顯示所制備的ＨＰＢＺｓ具有良好的結(jié)晶性。進一步分析Ｘ線衍射圖??（圖１．６），發(fā)現(xiàn)所制備的ＨＰＢＺｓ的峰與標準卡片中的普魯士藍峰（ＰＤＦ：?７３－０６８７）??一致
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本文編號：2875998