發(fā)布時間：2020-11-09 02:30

　　 目前基因治療的最大挑戰(zhàn)仍然是高效、安全的基因載體和治療基因的選擇。明膠硅氧烷納米顆粒(GS NPs)具有低毒性,表面易修飾,易于重復(fù)合成等優(yōu)點,由于其表面帶有較大量的正電荷,可作為一種潛在的基因載體材料,介導(dǎo)目的基因進(jìn)入細(xì)胞并轉(zhuǎn)染。作為一種非病毒基因載體,其低轉(zhuǎn)染效率是制約因素。本課題通過將細(xì)胞穿膜肽Tat修飾到GS NPs表面從而提高轉(zhuǎn)染效率。Tat是一段取自人類免疫性缺陷病毒1(HIV-1)蛋白中的48-62位氨基酸序列(KYGRRRQRRKKRGC)的多肽,含有一定的核定位序列,可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)和DNA進(jìn)入細(xì)胞核區(qū)域,并能促進(jìn)細(xì)胞對多種材料的內(nèi)吞效率。此外,p53作為一種抑癌基因,在正常情況下發(fā)揮監(jiān)測作用,參與細(xì)胞對DNA損傷的應(yīng)答,與細(xì)胞周期、凋亡和分化有關(guān)。因此采用溶膠-凝膠法合成GS NPs,并通過Tat共價修飾,攜載p53基因?qū)Ω伟┑囊种菩Ч潜菊n題的主要研究方向。方法:1)合成納米明膠硅氧烷,以Tat共價連接修飾得到Tat-GS NPs,通過場發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM)、透射電鏡(TEM)、動態(tài)光散射粒徑分析(DLS)、表面Zeta電位檢測、傅立葉變換紅外光譜(FTIR)、熱重分析儀(TG)等表征方式對其修飾前后的形貌、粒徑、表面電位、結(jié)構(gòu)組成、有機物含量等進(jìn)行分析比較。2)凝膠電泳實驗檢測GS NPs和Tat-GS NPs對p EGFP-C1-p53(p DNA)的包封率、釋放性、復(fù)合物穩(wěn)定性進(jìn)行研究,并通過粒徑和電位分析選取進(jìn)入細(xì)胞的較合適的負(fù)載量比。3)評價Tat修飾前后納米顆粒的生物相容性;體外轉(zhuǎn)染熒光觀察評價其作為基因載體的可行性,并進(jìn)一步探討納米粒子進(jìn)入細(xì)胞情況和逃逸溶酶體情況。4)MTT法檢測GS NPs、Tat-GS NPs攜載p53對肝癌的抑制效果。Hoechst 33258凋亡細(xì)胞染色和Western blot實驗研究其抑癌機理。結(jié)果:1)制備的明膠硅氧烷納米顆粒及Tat修飾后(簡稱Tat-GS)呈不規(guī)則球狀,Tat-GS出現(xiàn)聚集傾向,平均粒徑為289 nm相比于250 nm的GS,有所增大。GS、Tat-GS的表面電位分別為38 m V和35 m V。2)Tat修飾后對p DNA的包封率降低,Tat-GS/p53在質(zhì)量比為100∶1時才能實現(xiàn)完全包裹,而GS/p53在質(zhì)量比30∶1下就能完全包裹。但Tat的修飾對其釋放性和穩(wěn)定性基本無影響。且通過粒徑、電位分析表明納米粒子和p DNA在質(zhì)量比為200∶1時合成的復(fù)合物粒徑較小,表面呈一定的正電位,有利于細(xì)胞的胞吞進(jìn)入,因此后續(xù)納米復(fù)合物均采用200∶1質(zhì)量比合成。3)毒性實驗表明GS具有良好的生物相容性,且Tat的修飾幾乎對毒性無影響,生物安全性較高,且對p DNA的轉(zhuǎn)染實驗表明Tat-GS具有較高的轉(zhuǎn)染效率,其原因是Tat作為一種穿膜肽,具有增強載體復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞的能力和逃逸溶酶體的能力。4)Tat-GS-p53對肝癌細(xì)胞具有更強的抑制效果,其抑癌作用可能是由介導(dǎo)p53蛋白的表達(dá),引起細(xì)胞凋亡的作用。
【學(xué)位單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R450;R735.7
【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞
第一章 緒論
    1.1 引言
    1.2 基因治療
    1.3 病毒載體
    1.4 非病毒載體
        1.4.1 陽離子聚合物
        1.4.2 陽離子脂質(zhì)體
        1.4.3 無機納米載體
        1.4.4 有機-無機雜化材料
    1.5 非病毒基因載體的遞送屏障
        1.5.1 非病毒載體的細(xì)胞外轉(zhuǎn)運
        1.5.2 非病毒載體的跨膜轉(zhuǎn)運
        1.5.3 非病毒載體的內(nèi)涵體轉(zhuǎn)運
        1.5.4 細(xì)胞核轉(zhuǎn)運
    1.6 p53基因
    1.7 本課題研究內(nèi)容
第二章 納米明膠硅氧烷的制備及修飾
    2.1 引言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 實驗材料
        2.2.2 實驗方法
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 不同pH條件下的GS納米顆粒
        2.3.2 Tat修飾的納米顆粒表征結(jié)果
    2.4 本章小結(jié)
第三章 納米顆粒與p53復(fù)合物制備研究
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實驗材料
        3.2.2 實驗方法
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 質(zhì)粒的鑒定
        3.3.2 納米顆粒對p53基因的包封性
        3.3.3 復(fù)合物的粒徑和表面Zeta電位
        3.3.4 納米復(fù)合物的穩(wěn)定性檢測
        3.3.5 納米顆粒對p53基因的釋放性
    3.4 本章小結(jié)
第四章 納米顆粒的生物相容性、轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞內(nèi)定位研究
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 實驗材料
        4.2.2 實驗方法
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 納米明膠硅氧烷的生物相容性結(jié)果
        4.3.2 體外轉(zhuǎn)染熒光觀察
        4.3.3 不同納米顆粒復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞情況
        4.3.4 不同納米顆粒逃逸溶酶體情況
    4.4 本章小結(jié)
第五章 對肝癌的抑癌效果研究
    5.1 引言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 實驗材料
        5.2.2 實驗方法
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 MTT法檢測體外抑癌效果
        5.3.2 Hoechst33258染色觀察細(xì)胞凋亡
        5.3.3 Western blot檢測p53蛋白的表達(dá)水平
    5.4 本章小結(jié)
第六章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
碩士期間研究成果
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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1 董秀芳;制備有機-無機納米復(fù)合材料方法研討[J];華北工學(xué)院學(xué)報;2004年04期

2 劉關(guān)心,奚紅霞,鄭順濤,韋利飛,李忠;Sol-Gel法制備鍵合型有機/無機復(fù)合非線性光學(xué)材料[J];離子交換與吸附;2004年03期

本文編號：2875741