發(fā)布時(shí)間：2020-11-08 17:23

　　 蛋白質(zhì)是一類重要的生物大分子,是生命功能的主要承擔(dān)者。當(dāng)具有某種特定功能的蛋白質(zhì)發(fā)生表達(dá)異�；蚬δ墚惓r(shí),可能導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生病變甚至癌變。蛋白質(zhì)的表達(dá)研究能夠揭示細(xì)胞的生理或病理狀態(tài),揭示藥物或環(huán)境等因素對(duì)細(xì)胞的影響,幫助我們深入地了解生理和病理現(xiàn)象,了解疾病的發(fā)生、發(fā)展和治療效果。而生物樣本中特定蛋白質(zhì)的檢測(cè)對(duì)于疾病的診斷、治療和藥物篩選等也具有十分重要的意義。具有診斷和治療意義的蛋白質(zhì)通常在體液中的含量極低,加上生物體內(nèi)源性物質(zhì)的干擾,這就使得這些蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法必須具有較高的靈敏度和特異性。目前,常用的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、電泳法、質(zhì)譜法、電化學(xué)法和熒光法等。其中,熒光法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和操作簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)。近年來(lái),以納米材料擴(kuò)增技術(shù)和核酸擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)構(gòu)建的蛋白質(zhì)靈敏檢測(cè)方法為生物樣本中蛋白質(zhì)的分析提供了有利手段。本論文以滾環(huán)擴(kuò)增(Rolling circle amplification,RCA)、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Hybridization chain reaction,HCR)和催化發(fā)夾自組裝(Catalytic hairpin assembly,CHA)等擴(kuò)增策略為基礎(chǔ),選擇血小板源生長(zhǎng)因子 BB(Platelet-derived growth factor,PDGF-BB)、腫瘤壞死因子 a(Tumor necrosis factor a,TNF-a)、干擾素γ(Interferon γ,IFN-γ)和酪氨酸蛋白激酶7(Tyrosine protein kinase 7,PTK7)為分析模型,構(gòu)建了用于生物樣本中或細(xì)胞膜表面蛋白質(zhì)檢測(cè)的新型熒光生物傳感方法。本論文主要分為六章:第一章為緒論部分,主要概述了蛋白質(zhì)的功能、檢測(cè)意義和蛋白質(zhì)的靈敏檢測(cè)方法,以及本論文解決的科學(xué)問題和主要研究?jī)?nèi)容。第二章,構(gòu)建了一個(gè)新型“自封閉”適體探針,該探針包含兩個(gè)功能區(qū)域:(1)適體序列,位于探針的3'末端,具有目標(biāo)物識(shí)別的功能;(2)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)序列,位于探針的5'末端,具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能。另外,探針的適體序列與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)序列可部分雜交,具有“自我封閉”的功能。在相同堿基數(shù)目的情況下,分子內(nèi)雜交較分子間雜交更穩(wěn)定,因此,該“自封閉”適體探針較己報(bào)道的阻滯鏈封閉的適體探針更穩(wěn)定,有利于降低探針非特異性折疊產(chǎn)生的背景信號(hào)。結(jié)合鏈取代擴(kuò)增反應(yīng)(Strand displacement amplification,SDA)和雙重指數(shù)型滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(Dual exponential rolling circle amplification,DE-RCA),我們構(gòu)建了一個(gè)“自封閉”適體探針介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)擴(kuò)增策略,實(shí)現(xiàn)了 PDGF-BB的超靈敏檢測(cè),檢測(cè)限為0.38 fM,線性范圍超過6個(gè)數(shù)量級(jí),優(yōu)于阻滯鏈封閉的適體探針介導(dǎo)的相同擴(kuò)增策略的結(jié)果。通過替換探針中的適體序列,本方法還實(shí)現(xiàn)了對(duì)小分子腺苷的靈敏、特異檢測(cè),說(shuō)明該策略能夠拓展用于多種目標(biāo)物的靈敏分析,在生物檢測(cè)領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力。第三章,構(gòu)建了一個(gè)DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)催化組裝驅(qū)動(dòng)的三維DNA walker。該walker以核酸修飾的磁納米顆粒(Magnetic nanobeads,MNBs)為運(yùn)行軌道,以單純的DNA雜交反應(yīng)為驅(qū)動(dòng)力,能夠在核酸或蛋白質(zhì)的觸發(fā)下自發(fā)進(jìn)行。與酶驅(qū)動(dòng)的三維DNA walker相比,該催化組裝驅(qū)動(dòng)的DNA walker更加簡(jiǎn)單和通用,通過更換識(shí)別元素,可用于核酸和蛋白質(zhì)等生物分子的分析。以Smallpox gene為核酸分析模型,本方法的檢測(cè)限達(dá)4.1 fM;以PDGF-BB為蛋白分析模型,檢測(cè)限達(dá)2.3 fM,說(shuō)明該walker體系可用于多種特定目標(biāo)物的檢測(cè),在生物傳感領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用價(jià)值。第四章,構(gòu)建了一個(gè)基于雙條碼策略和單分子計(jì)數(shù)的細(xì)胞因子多重檢測(cè)方法。IFN-γ和TNF-α與一系列生理和病理過程如肺結(jié)核、HIV感染和黑色素瘤等密切相關(guān),因此被選為分析模型。本方法中,通過抗體-抗原-磁納米探針復(fù)合物的形成引入一級(jí)條碼鏈;通過一級(jí)條碼鏈觸發(fā)的多分枝HCR反應(yīng)產(chǎn)生二級(jí)條碼鏈;通過二級(jí)條碼鏈捕獲熒光探針,產(chǎn)生熒光;通過分別清點(diǎn)熒光點(diǎn)的數(shù)目,對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定量,實(shí)現(xiàn)了 IFN-y和TNF-a的同時(shí)、靈敏檢測(cè),檢測(cè)限均為5fM。本方法中的條碼策略與經(jīng)典的條碼分析方法不同,無(wú)需對(duì)條碼鏈進(jìn)行解離和再固定,避免了條碼鏈的損失和交叉雜交。此外,我們利用該方法對(duì)人血漿中的IFN-y和TNF-α進(jìn)行了同時(shí)定量,說(shuō)明該方法在疾病的早期臨床診斷中具有較大的應(yīng)用潛力。第五章,構(gòu)建了一個(gè)結(jié)合誘導(dǎo)的切刻酶位點(diǎn)重構(gòu)策略,用于活細(xì)胞表面膜蛋白的定量分析。本方法中,首先,我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)含有適體序列、觸發(fā)序列和切刻酶識(shí)別位點(diǎn)的適體探針;沒有目標(biāo)物時(shí),適體探針以發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形式存在,此時(shí),切刻酶識(shí)別位點(diǎn)的兩段互補(bǔ)序列相互分離,因而不能被切刻酶識(shí)別和切割;有目標(biāo)物時(shí),適體探針與目標(biāo)物結(jié)合綁定誘導(dǎo)探針發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變,同時(shí)使切刻酶識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生重構(gòu),觸發(fā)序列暴露;接著,切刻酶識(shí)別該位點(diǎn)并進(jìn)行切割反應(yīng),釋放觸發(fā)序列;最后,游離的觸發(fā)序列在均相條件下觸發(fā)級(jí)聯(lián)的RCA和HCR反應(yīng),生成一條含有多個(gè)G-四倍體結(jié)構(gòu)的多分枝DNA聚合物,實(shí)現(xiàn)信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大。本方法實(shí)現(xiàn)了 PTK7的超靈敏檢測(cè),檢測(cè)限為0.3 fM。此外,本也實(shí)現(xiàn)了對(duì)活細(xì)胞表面PTK7的定量分析,并可區(qū)分正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞以及不同腫瘤細(xì)胞之間PTK7的表達(dá)差異,說(shuō)明本方法為活細(xì)胞表面膜蛋白的定量檢測(cè)提供了一個(gè)可靠的手段。第六章為結(jié)論和展望部分,對(duì)本論文的研究成果進(jìn)行了總結(jié)和展望。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R446.1
【部分圖文】：

除了直接富集信號(hào)分子，納米材料也可富集信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，常用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)??分子是寡核苷酸序列，這是一種將蛋白質(zhì)檢測(cè)轉(zhuǎn)化為ＤＮＡ檢測(cè)的信號(hào)擴(kuò)増模式。??Ｍｉｒｋｉｎ課題組首次提出了蛋白質(zhì)分析的生物條形碼策略５１，如圖１－２Ａ，首先，??在ＡｕＮＰｓ表面修飾檢測(cè)抗體和大量單鏈ＤＮＡ分子，同時(shí)在ＭＮＢｓ表面修飾捕??獲抗體；然后，通過抗原抗體的特異性結(jié)合作用形成ＡｕＮＰｓ－抗原－ＭＮＢｓ復(fù)合物，??利用磁分離技術(shù)將其分離后，將單鏈ＤＮＡ分子從ＡｕＮＰｓ上解離下來(lái)，并利用銀??４??

過在ＡｕＮＰｓ和ＭＮＢｓ上修飾不同的抗體和ＤＮＡ序列，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的多重檢??測(cè)５２。Ｊｉａｎｇ課題組利用ＭＮＢｓ富集ＤＮＡ分子，也實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的靈敏檢測(cè)５３，??如圖１－２Ｂ，首先，構(gòu)建檢測(cè)抗體和大量雙鏈ＤＮＡ分子修飾的磁納米探針，同時(shí)??將目標(biāo)物固定在基底上；接著，通過抗原和抗體的免疫結(jié)合作用，將磁納米探針??固定在基底上，利用磁分離技術(shù)洗去多余探針；最后，在雙鏈ＤＮＡ分子中插入??熒光染料，實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的擴(kuò)增。該方法實(shí)現(xiàn)了人免疫球蛋白ＧＯｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ??ＧｌｇＧ）的靈敏檢測(cè)，檢測(cè)限為３．０?ｆＭ。在此基礎(chǔ)上，該課題組又分別引入雜交??鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ?ｃｈａｉｎ?ｒｅａｃｔｉｏｎ，?ＨＣＲ）和滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)（Ｒｏｌｌｉｎｇ?ｃｉｒｃｌｅ??ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＲＣＡ），分別將檢測(cè)限降低至?１４?ａＭ３４?和?８．３?ａＭ５５。??（Ａ）??ｆ?＾?＾??Ｕ？ｎ〇ｆ？ｖｃｌ＊?ＭＰ）?Ｐｔｔｌｍ?ｆ?－ｔ／Ｊ－?＾?＾Ａｒ＾＇??Ｖ８?ｊＬ＿?＜３?ｏｎ?Ｗ＞ｔ??Ｘ?ｅ？?Ｈ？＊?ｔｅ＊?？ＣＫ４ｍ（?ＭＭｒｗｄ??Ｓ?＞？＜？？■?Ｗｏ、?Ｓｔｅｐｓ??ＪＪｉＬ．??冬．ＯＨ＊?／?，，?＇?＇?二邊．．??Ｖ－一＾一？一?／?二．??Ｕ?（ＵＫ?？＜０＊＊＞?＃？？？?Ｗ??碰?Ｍ?

有利于信號(hào)的檢出。因此，作為一種新型熒光探針，ＱＤｓ被廣泛用于蛋白??質(zhì)的靈敏檢測(cè)。Ｚｈｅｎｇ課題組利用ＱＤｓ表面帶負(fù)電和朊蛋白表面帶正電的性質(zhì)，??將ＱＤｓ用于朊蛋白的檢測(cè)６５，原理見圖１－３，在ＱＤｓ過量的情況下，ＱＤｓ與朊??蛋白靜電結(jié)合，形成龐大的ＱＤｓ－阮蛋白聚合物，改變ＱＤｓ的熒光特性，通過測(cè)??定熒光信號(hào)進(jìn)行定量。Ｘｕ課題組利用不同尺寸ＱＤｓ熒光光譜不同的特點(diǎn)，構(gòu)建??了一個(gè)蛋白質(zhì)多重分析方法６６，該方法構(gòu)建了?ＱＤｓ標(biāo)記的檢測(cè)抗體，利用抗體－??抗原的特異性結(jié)合作用，實(shí)現(xiàn)了?５種目標(biāo)物的同時(shí)檢測(cè)。Ｌｉｕ等以ＱＤｓ為熒光標(biāo)??記構(gòu)建了一個(gè)磁球微陣列，實(shí)現(xiàn)了肺癌標(biāo)志物ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ２１－１和ＮＳＥ的靈敏??檢測(cè)，檢測(cè)限分別為?０．１９?ｎｇ／ｍＬ、０．９７?ｎｇ／ｍＬ?和?０．３７?ｎｇ／ｍＬ６７。??？?＊?？?＿??－?＊?．ｍｔ＊．?＊??－．、Ｔ＇??？＇?ｍｆ?ｉｍ??圖１－３?ＱＤｓ用于蛋白質(zhì)的靈敏檢測(cè)６５??金納米顆粒（ＡｕＮＰｓ）是一種直徑在ｌ￣１００ｎｍ之間的微小金顆粒，具有較??高的電子密度和介電特性
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 張華金 ,李娜 ,杜學(xué)志;干擾素的劑型及臨床應(yīng)用[J];華西藥學(xué)雜志;2004年01期

2 李巖,邵念鵬,彭玉麟;γ干擾素的研究與臨床應(yīng)用(綜述)[J];河北省科學(xué)院學(xué)報(bào);2001年03期

本文編號(hào)：2875092