一直以來傳統(tǒng)的治療方法存在著各種各樣的弊端,給患者帶來痛苦的同時(shí)疾病并不能得到根治。隨著醫(yī)學(xué)水平的發(fā)展,人們開始思考從基因水平上對(duì)疾病實(shí)施有效且根本性的治療,基因治療由此逐漸引起了人們的關(guān)注。因此本文開發(fā)一種基于還原敏感響應(yīng)的納米基因遞送系統(tǒng),利用細(xì)胞內(nèi)高GSH濃度呈現(xiàn)出的還原性環(huán)境,實(shí)現(xiàn)載體在細(xì)胞內(nèi)更快速的釋放基因,從而達(dá)到高的轉(zhuǎn)染效率。本論文主要的研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1.還原敏感響應(yīng)基因遞送載體的合成及表征。以側(cè)鏈被二亞乙基三胺(DET)修飾的聚天冬氨酸P[Asp(DET)]為結(jié)合基因的親水段,含有二硫鍵的胱胺作為連接臂,與疏水性聚乳酸-羥基乙酸共聚物PLGA連接合成新的還原敏感響應(yīng)的基因載體PLGA-ss-P[Asp(DET)](后文統(tǒng)一采用P-ss-P表示)。己二胺代替胱胺,連接PLGA與聚陽離子P[Asp(DET)],合成不含還原敏感二硫鍵的PLGA-P[Asp(DET)](后文統(tǒng)一采用P-P表示)作為對(duì)照;同時(shí)不含疏水鏈段的P[Asp(DET)]作為陽性對(duì)照。利用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)和核磁共振氫譜(~1H NMR)對(duì)P-ss-P的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,結(jié)果表明P-ss-P成功合成。載體P-ss-P在水溶液中能夠自組裝形成納米顆粒,透射電鏡(TEM)顯示納米顆粒呈分布較均勻的近似球形,粒徑在20-30 nm左右,且在144 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。緩沖能力實(shí)驗(yàn)表明P-ss-P具有較好的質(zhì)子緩沖能力。2.P-ss-P基因載體遞送外源基因能力的研究。將載體P-ss-P與報(bào)告基因pDsRed2-N1共同孵育制備載體/pDNA復(fù)合物并探究其性能。粒徑及電位分析結(jié)果顯示P-ss-P/pDNA復(fù)合物的粒徑為在100-350 nm之間,最終平穩(wěn)在120 nm左右,最大電位為30.93 mV。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明P-ss-P能與pDNA較好的結(jié)合,并且有效抵抗肝素鈉的競爭。同時(shí)載體P-ss-P能有效保護(hù)pDNA被核酸酶及血清中成分降解。MTT結(jié)果顯示P[Asp(DET)]、P-ss-P和P-P均具有較低的細(xì)胞毒性,并且與P[Asp(DET)]相比P-ss-P表現(xiàn)出更好的生物相容性。體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明P[Asp(DET)]和P-ss-P均能成功運(yùn)載外源基因至細(xì)胞并順利表達(dá),不同N/P(4、8、16)下P-ss-P/pDsRed2-N1復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率分別為9.0%、22.3%和26.3%。激光共聚焦及細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,P[Asp(DET)]/Cy5-pDNA、P-P/Cy5-pDNA和P-ss-P/Cy5-pDNA復(fù)合物均可通過內(nèi)吞方式被HeLa細(xì)胞攝取且攝取量遠(yuǎn)高于游離pDNA,具有疏水結(jié)構(gòu)的P-P和P-ss-P的細(xì)胞攝取量明顯高于P[Asp(DET)]組。3.基因載體還原敏感響應(yīng)性能的研究。DLS實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明P-ss-P在還原條件下表現(xiàn)出了粒徑增大現(xiàn)象,而在相同條件下P-P的粒徑則無明顯變化。電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在還原條件下P-ss-P與DNA的結(jié)合能力有所減弱,并且隨著孵育時(shí)間的增加,P-ss-P的DNA結(jié)合能力逐漸降低,而P-P/pDNA復(fù)合物不受還原條件的影響,在0-6 h內(nèi)均完全結(jié)合DNA。在體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染方面,P-ss-P/pDsRed2-N1顯示出比P-P更高的轉(zhuǎn)染效率。上述結(jié)果證明了P-ss-P具有較好的還原敏感性質(zhì)。4.P-ss-P用于體外癌癥基因治療效果的研究。通過MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)評(píng)估P-ss-P運(yùn)載治療基因p53的抑癌效果。與P-P相比,P-ss-P由于能更好運(yùn)載抑癌基因p53進(jìn)入癌細(xì)胞,表達(dá)抑癌蛋白,因而顯著抑制癌細(xì)胞的生長增殖。
【學(xué)位單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R450
【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 基因治療
    1.2 基因治療載體
        1.2.1 病毒載體
        1.2.2 非病毒載體
    1.3 刺激響應(yīng)型基因納米遞送載體
        1.3.1 外源刺激響應(yīng)型基因納米載體
        1.3.2 內(nèi)源刺激響應(yīng)型基因納米載體
    1.4 還原敏感響應(yīng)型基因納米遞送載體研究進(jìn)展
    1.5 本論文的選題依據(jù)及研究內(nèi)容
2 還原敏感響應(yīng)載體材料的合成及表征
    2.1 試劑和儀器
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及材料
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 載體材料合成
        2.2.2 載體材料結(jié)構(gòu)分析
        2.2.3 透射電子顯微鏡分析（TEM）
        2.2.4 穩(wěn)定性的檢測
        2.2.5 緩沖能力分析
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 載體材料的合成及結(jié)構(gòu)分析
        2.3.2 透射電子顯微鏡分析（TEM）
        2.3.3 載體穩(wěn)定性檢測
        2.3.4 緩沖能力分析
    2.4 小結(jié)
3 P-ss-P載體遞送外源基因能力的研究
    3.1 試劑和儀器
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及材料
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 P-ss-P/pDNA復(fù)合物的制備
        3.2.2 P-ss-P/pDNA復(fù)合物的形貌表征
        3.2.3 載體與pDNA結(jié)合穩(wěn)定性檢測
        3.2.4 載體對(duì)DNA的保護(hù)能力分析
        3.2.5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
        3.2.6 P[Asp（DET）]/pDNA和 P-ss-P/pDNA體外轉(zhuǎn)染
        3.2.7 P[Asp（DET）]/Cy5-pDNA和 P-ss-P/Cy5-pDNA的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)
        3.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 P-ss-P/pDNA復(fù)合物的表征
        3.3.2 P-ss-P結(jié)合pDNA的能力
        3.3.3 載體對(duì)DNA的保護(hù)能力分析
        3.3.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
        3.3.5 P[Asp（DET）]/pDsRed2-N1和P-ss-P/pDsRed2-N1 體外轉(zhuǎn)染
        3.3.6 P[Asp（DET）]和P-ss-P的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)
    3.4 小結(jié)
4 P-ss-P載體還原敏感響應(yīng)性能研究及抑癌實(shí)驗(yàn)
    4.1 試劑及儀器
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及材料
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 還原環(huán)境下的粒徑變化
        4.2.2 還原條件下載體與pDNA結(jié)合穩(wěn)定性檢測
        4.2.3 P-P/pDsRed2-N1和P-ss-P/pDsRed2-N1 體外轉(zhuǎn)染
        4.2.4 抑癌實(shí)驗(yàn)
        4.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 還原環(huán)境下載體粒徑變化的結(jié)果
        4.3.2 還原條件下載體與pDNA結(jié)合穩(wěn)定性的檢測
        4.3.3 P-P/pDsRed2-N1和P-ss-P/pDsRed2-N1 體外轉(zhuǎn)染
        4.3.4 抑癌實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    4.4 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝

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