研究背景及目的早期及時有效的腸道護(hù)理干預(yù)措施對嚴(yán)重?zé)齻颊叩木戎螛O其重要。腸黏膜屏障功能損害和腸道通透性增加是嚴(yán)重?zé)齻驘艔?fù)合傷后腸道細(xì)菌移位、膿毒癥及死亡的重要影響因素,因此腸黏膜屏障功能的恢復(fù)是嚴(yán)重?zé)齻颊咴缙谀c道護(hù)理中的重要內(nèi)容。既往的研究表明,嚴(yán)重?zé)齻缙跈C體低血容量性休克引起全身性組織器官的缺血缺氧性損害,而過度且持久的缺血缺氧性損害是腸黏膜屏障功能損害的重要因素之一。緊密連接(TJ)位在于腸黏膜細(xì)胞膜的邊緣和頂部,是腸黏膜屏障中的重要組成之一,在維持腸道通透性中發(fā)揮十分重要的作用。由于影響燒傷后腸黏膜緊密連接屏障損害的因素極其復(fù)雜,因此目前具體的分子機制仍尚未完全清楚。已有研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬相互作用,并且與炎癥性腸病的發(fā)生與發(fā)展有著密切的聯(lián)系。當(dāng)腸上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)未能通過未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)得以重建,過度或持久內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則能激活自噬,導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡,從而造成腸黏膜損害。因此,我們假設(shè)嚴(yán)重?zé)齻ㄟ^改變腸黏膜內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平引起自噬,致使緊密連接蛋白的表達(dá)和分布發(fā)生變化,導(dǎo)致腸黏膜緊密連接屏障損害和通透性增加。本課題通過建立嚴(yán)重?zé)齻∈竽Ｐ秃腕w外建立單層腸上皮細(xì)胞模型,探究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬通路在嚴(yán)重?zé)齻竽c黏膜緊密連接屏障損害中的作用及其機制,闡明嚴(yán)重?zé)齻竽c黏膜緊密連接屏障損害的發(fā)生機制,進(jìn)一步明確了腸黏膜屏障功能在腸道護(hù)理中的重要作用,為嚴(yán)重?zé)齻拔Ｖ匕Y患者腸道護(hù)理提供了新的指導(dǎo)思路,為探索精準(zhǔn)有效的醫(yī)療與護(hù)理措施提供新的干預(yù)靶點與思路。方法1.健康成年C57BL/6小鼠隨機分為對照組和燒傷組,燒傷小鼠建立30%TBSA III度燒傷模型,觀察時相點為1h、2h、6h、12h及24h。2.健康成年C57BL/6小鼠隨機分為對照組、Tm組(1.0mg/kg)、Tg組(300ng/kg)、4-PBA組(80mg/kg)、單純燒傷組、燒傷+Tm組(1.0mg/kg)、燒傷+Tg組(300ng/kg)以及燒傷+4-PBA組(80mg/kg),所有燒傷小鼠均建立30%TBSA III度燒傷模型,時相點為燒傷后6h。3.健康成年C57BL/6小鼠隨機分為對照組、RAPA組(4mg/kg)、3-MA組(15mg/kg)、單純燒傷組、燒傷+RAPA組(4mg/kg)以及燒傷+3-MA組(15mg/kg),所有燒傷小鼠均建立30%TBSA III度燒傷模型,時相點為燒傷后6h。4.將單層Caco-2腸上皮細(xì)胞隨機分為對照組和缺氧組,缺氧組細(xì)胞進(jìn)行缺氧處理(1%O_2、5%CO_2和94%N_2混合氣體培養(yǎng)),時相點為1h、2、6h、12h及24h。5.將單層Caco-2細(xì)胞隨機分為常氧組、常氧+Tm組(5μg/mL)、常氧+Tg組(1μmol/L)、常氧+4-PBA組(2mmol/L)、缺氧組、缺氧+Tm組(5μg/mL)、缺氧+Tg組(1μmol/L)以及缺氧+4-PBA組(2mmol/L)。時相點為缺氧后6h。6.將單層Caco-2細(xì)胞隨機分為常氧組、常氧+RAPA組(50nmol/L)、常氧+3-MA組(10mmol/L)、缺氧組、缺氧+RAPA組(50nmol/L)及缺氧+3-MA組(10mmol/L)。時相點為缺氧后6h。7.用異硫氰酸熒光素葡聚糖(fluorescein isothiocyanate-dextran,FITC-dextran)示蹤法檢測小鼠腸道及單層Caco-2細(xì)胞通透性。8.用間接免疫熒光法分別檢測腸黏膜組織ZO-1蛋白和LC3B蛋白的表達(dá)與分布,以及單層Caco-2細(xì)胞TJ蛋白ZO-1、occludin和claudin-1蛋白的表達(dá)與分布,在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。9.對小鼠腸黏膜組織進(jìn)行HE染色,在光鏡下觀察其組織結(jié)構(gòu)的變化并拍照。10.透射電鏡分別檢測腸黏膜上皮細(xì)胞和單層Caco-2細(xì)胞中的自噬小體并拍照。11.用電阻測定儀檢測單層Caco-2細(xì)胞跨細(xì)胞電阻(transepithelial electrical resistance,TER)。12.Western blot法檢測腸黏膜組織及Caco-2細(xì)胞ZO-1、occludin、claudin-1、claudin-2、BIP、CHOP、XBP1、XBP1s、LC3-II/LC3-I、Beclin 1、Atg5和P62蛋白表達(dá)的變化。13.GFP-LC3B融合蛋白示蹤單層Caco-2細(xì)胞自噬體的形成情況。研究結(jié)果1.嚴(yán)重?zé)齻麑?dǎo)致小鼠腸道通透性增加,腸黏膜TJ屏障損害以及ERS和自噬水平顯著增強。(1)嚴(yán)重?zé)齻∈竽c道通透性顯著升高。(2)嚴(yán)重?zé)齻∈竽c黏膜TJ蛋白ZO-1、occludin,claudin-1蛋白表達(dá)下降,claudin-2蛋白表達(dá)升高。且ZO-1蛋白的分布發(fā)生明顯改變。(3)光鏡下觀察發(fā)現(xiàn),嚴(yán)重?zé)齻∈竽c黏膜組織結(jié)構(gòu)明顯受損。(4)嚴(yán)重?zé)齻∈竽c黏膜內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平明顯增強。(5)嚴(yán)重?zé)齻竽c黏膜自噬水平發(fā)生顯著增強。(6)嚴(yán)重?zé)齻∈竽c黏膜PI3K/AKT/mTOR信號通路明顯受到抑制。2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬通路激活參與了嚴(yán)重?zé)齻∈竽c黏膜TJ屏障功能損害的發(fā)生。(1)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性誘導(dǎo)劑Tm與Tg提高了燒傷后小鼠腸黏膜內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平,并進(jìn)一步增強嚴(yán)重?zé)齻∈竽c黏膜自噬水平以及PI3K/AKT/mTOR信號通路的下調(diào);內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性抑制劑4-PBA明顯降低了嚴(yán)重?zé)齻∈竽c黏膜內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞自噬水平,且上調(diào)PI3K/AKT/mTOR信號通路。(2)Tm與Tg均顯著促進(jìn)嚴(yán)重?zé)齻∈竽c道通透性的進(jìn)一步增加,明顯加重了腸黏膜屏障功能的損害,4-PBA則顯著降低了燒傷小鼠腸道通透性,明顯堅強了嚴(yán)重?zé)齻履c黏膜屏障功能損害。(3)自噬特異性誘導(dǎo)劑RAPA明顯增強了嚴(yán)重?zé)齻∈竽c黏膜細(xì)胞自噬水平;自噬特異性抑制劑3-MA則明顯抑制了嚴(yán)重?zé)齻∈竽c黏膜細(xì)胞自噬水平。(4)RAPA促使嚴(yán)重?zé)齻∈竽c道通透性的進(jìn)一步增加,加重腸黏膜屏障功能的損害;3-MA則顯著降低了嚴(yán)重?zé)齻∈竽c道通透性,明顯減輕了嚴(yán)重?zé)齻碌哪c黏膜屏障功能損害。3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬通路激活參與了缺氧引起的腸上皮細(xì)胞TJ屏障功能損害。(1)缺氧引起單層Caco-2細(xì)胞TER降低,通透性增加。(2)缺氧使單層Caco-2細(xì)胞TJ蛋白ZO-1、occludin與claudin-1蛋白表達(dá)下降,且分布發(fā)生明顯改變。(3)缺氧引起單層Caco-2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬水平均顯著增加。(4)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性誘導(dǎo)劑Tm和Tg均明顯增強缺氧單層Caco-2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬水平,進(jìn)一步下調(diào)缺氧單層Caco-2細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號通路;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性抑制劑4-PBA則顯著抑制缺氧單層Caco-2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬水平,上調(diào)缺氧單層Caco-2細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號通路。(5)Tm與Tg均引起缺氧單層Caco-2細(xì)胞TER進(jìn)一步下降,通透性進(jìn)一步增加,加重缺氧單層Caco-2細(xì)胞屏障功能損害;4-PBA顯著增加缺氧單層Caco-2細(xì)胞TER,降低通透性,明顯減輕缺氧單層Caco-2細(xì)胞屏障功能損害。(6)自噬特異性誘導(dǎo)劑RAPA增強缺氧單層Caco-2細(xì)胞自噬水平,自噬特異性抑制劑3-MA降低缺氧單層Caco-2細(xì)胞自噬水平。(7)RAPA引起缺氧單層Caco-2細(xì)胞TER進(jìn)一步降低,通透性進(jìn)一步增加,加重屏障功能損害;3-MA顯著增加缺氧單層Caco-2細(xì)胞TER,降低通透性,明顯減輕缺氧所致單層Caco-2細(xì)胞腸屏障功能損害。研究結(jié)論1.嚴(yán)重?zé)齻笮∈竽c道通透性增加,腸黏膜TJ屏障功能損害,且腸黏膜內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬水平均顯著增加。2.嚴(yán)重?zé)齻鸬牡膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過PI3K/AKT/mTOR信號通路激活細(xì)胞自噬,且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬的激活均參與了嚴(yán)重?zé)齻∈竽c黏膜TJ屏障功能損害的發(fā)生。3.缺氧引起單層Caco-2細(xì)胞TER明顯降低,通透性增加,腸上皮細(xì)胞TJ屏障功能損害,且細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬水平均顯著增加。4.缺氧引起的單層Caco-2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過PI3K/AKT/mTOR信號通路激活自噬,且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬通路的激活參與了單層Caco-2細(xì)胞TJ屏障功能損害的發(fā)生。5.本研究進(jìn)一步證明了嚴(yán)重?zé)齻颊咴缙�、有效用氧和早期胃腸道營養(yǎng)支持的重要性,為護(hù)理人員進(jìn)一步研究嚴(yán)重?zé)齻颊咴缙诰珳?zhǔn)有效護(hù)理舉措提供了新的實驗依據(jù)。6.進(jìn)一步明確了嚴(yán)重?zé)齻缙谀c黏膜屏障功能在腸道護(hù)理中的重要性,為嚴(yán)重?zé)齻颊吣c道護(hù)理提供了新的思考點,為下一步探索精準(zhǔn)有效的醫(yī)療與護(hù)理措施提供新的干預(yù)靶點及研究思路。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R473.6
【文章目錄】：
縮略語表
英文摘要
中文摘要
第一章 前言
第二章 嚴(yán)重?zé)齻∈竽c道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬及黏膜屏障功能的變化
    2.1 材料與方法
    2.2 實驗結(jié)果
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
第三章 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬通路在嚴(yán)重?zé)齻竽c黏膜緊密連接屏障功能損害中的作用
    3.1 材料與方法
    3.2 實驗結(jié)果
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
第四章 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬通路在缺氧腸上皮細(xì)胞緊密連接屏障損害中的作用與機制
    4.1 材料與方法
    4.2 實驗結(jié)果
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
第五章 嚴(yán)重?zé)齻颊咴缙谀c屏障損害機制研究對腸道護(hù)理的啟示
    5.1 對嚴(yán)重?zé)齻颊咴缙谟醚醴绞降淖o(hù)理啟示
    5.2 對嚴(yán)重?zé)齻颊咴缙跔I養(yǎng)支持的護(hù)理啟示
全文結(jié)論
本課題創(chuàng)新點
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述 自噬、腸黏膜屏障與腸道護(hù)理
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間的研究成果
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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1 李堅;;嚴(yán)重?zé)齻∪嗽缙谀c道營養(yǎng)與護(hù)理的進(jìn)展[J];齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2012年01期

本文編號：2866494