基于PLP-RCA的唐氏綜合癥產前篩查方法的建立與優(yōu)化

發(fā)布時間：2020-11-01 02:34

　　研究背景及目的:唐氏綜合癥(DS)是一種常見的不可治愈的染色體病,目前只能通過產前干預的手段阻止患兒的出生。傳統的產前篩查方法假陽性率高;快速產前診斷方法其創(chuàng)傷性的取樣方式對孕婦和胎兒有一定的損傷風險;無創(chuàng)DNA產前篩查方法借助于成熟的測序公司,成本高、在偏遠地區(qū)不易普及,因此建立安全、有效、易于推廣的DS產前篩查方法至關重要。母體胎兒游離核酸是無創(chuàng)產前診斷最好的樣品,但是因其含量低,受母體背景干擾等問題,需要靈敏度高、特異性好的方法對其檢測以實現對DS產前篩查。本課題基于鎖式探針-滾環(huán)擴增(PLP-RCA)具有對單核苷酸多態(tài)性(SNP)基因分型及定量能力,擬建立一種靈敏度高、特異性好的PLP-RCA用于DS產前篩查,為無創(chuàng)性的DS產前篩查提供新方法。研究方法:(1)依據胎兒特異表達的基因雜合型“RNA-SNP”等位基因比值定量的方法,選擇雜合率較高的胎兒特異基因的SNP。對PLP-RCA的反應體系進行優(yōu)化,對靶分子濃度與終點熒光值之間的定量關系進行檢測,實現PLP-RCA對SNP等位基因分型及比值定量。(2)改進的指數線性PCR(imLATE-PCR)對靶分子進行信號放大產生單鏈DNA,經過信號放大的靶分子進行PLP-RCA均得到擴增產物,結合imLATE-PCR,PLP-RCA的檢測靈敏度提高。(3)用合成的靶分子制備正常人和DS患者的模擬樣品,采用熒光定量PLP-RCA對模擬樣品進行篩查;用合成的靶分子制備正常人和DS患者的血漿模擬樣品,模擬臨床樣品的待測環(huán)境,采用熒光定量PLP-RCA對血漿模擬樣品進行篩查。研究結果:(1)確定了21號染色體COL6A2、PLAC4基因上雜合率較高的rs1044598位點、rs7717位點、rs59066201位點,三個位點在人群中的理論覆蓋率達到了84.7%。針對3個SNP位點設計鎖式探針,優(yōu)化了PLP-RCA反應體系,實現了對胎兒特異基因上SNP位點的基因分型。熒光定量PLP-RCA分析了兩倍濃度差的靶分子與終點熒光值之間有較好的線性關系,可檢測到1 nM的靶分子,實現了對胎兒特異基因上SNP等位基因比值定量。(2)設計了3個SNP位點imLATE-PCR的大量引物與限制性引物,均得到單鏈DNA產物。以這些產物為模板,進行熒光定量PLP-RCA實驗并分析了擴增產物濃度與終點熒光值之間的關系,結果二者之間具有較好的線性相關性,可檢測到1 pM的靶分子,PLPRCA檢測靈敏提高。(3)熒光定量PLP-RCA對正常人和DS患者的模擬樣品進行檢測,正常人模擬樣品SNP等位基因比值接近理論值1:1,DS患者模擬樣品SNP等位基因比值接近理論值2:1或1:2,實現了對DS患者模擬樣品的檢測,進一步實驗發(fā)現此方法初步實現了對DS患者血漿模擬樣品的檢測。結論:本研究對PLP-RCA反應體系進行優(yōu)化,建立了特異性檢測唐氏綜合癥相關SNP位點的方法,實現了PLP-RCA對胎兒特異基因上SNP位點的分型定量,通過增加改進的指數線性PCR反應,提高了PLP-RCA檢測靈敏度,初步實現了對DS模擬樣品的篩查,為下一階段臨床樣品的檢測奠定了基礎。
【學位單位】：華僑大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：O652;R714.5;R440
【部分圖文】：