血細胞計數(shù)是最常規(guī)的臨床檢測之一,對疾病的初步診斷和篩查具有重要的指導意義。大量研究顯示,基于流式或成像的便攜式血細胞計數(shù)儀器具備準確的血細胞計數(shù)能力,但這些方法普遍存在的問題是:簡單的實驗操作只能獲得單一的參數(shù),或者需要使用多種試劑來進行復雜的樣品前處理,或者需要多個儀器部件來實現(xiàn)多個參數(shù)的檢測。本課題組前期開發(fā)了一套基于血細胞大視場成像的小型顯微鏡系統(tǒng),實現(xiàn)了對血細胞的準確計數(shù),但該方法采用了表面活性劑與熒光染料分別對血樣進行紅細胞球化和白細胞、血小板染色,它們的混合物對染色的熒光強度造成較大影響。同時,該方法進樣時使用的是商業(yè)樣品池,其厚度為精確的100μm,價格較為昂貴。這樣的樣品制備方法達不到便攜式檢測的實際需求。為了解決這個問題,我們開發(fā)了一套面向便攜式血細胞計數(shù)的簡單、高效的樣品制備方法,其主要內(nèi)容包括:(1)選擇兩性表面活性劑N,N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十八烷銨內(nèi)鹽(DOPS),代替陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)。DOPS對白細胞和血小板熒光染色的強度沒有影響,因此與熒光染料具有良好的兼容性。同時,DOPS可以將紅細胞球化成規(guī)整形態(tài),且適用的血樣具有較寬的血細胞密度范圍。通過調(diào)整DOPS的濃度,結(jié)合染色劑濃度、環(huán)境pH及鹽離子濃度的優(yōu)化,我們確定了最佳的血樣制備條件。(2)通過調(diào)節(jié)血液稀釋倍數(shù)和控制樣品池深度,設(shè)計樣品池,使血細胞形成密度適中的單層分布。實驗結(jié)果表明,這種樣品池的效果不僅可以替代商業(yè)樣品池,還較大幅度的降低了成本。將其與前述血樣制備的最佳條件相結(jié)合,我們實現(xiàn)了血樣的快速制備,以及紅細胞、白細胞和血小板的準確計數(shù)。(3)將DOPS與熒光染料吖啶橙(AO)以干劑形式預埋在離心管中,這種預儲存的策略,使試劑儲存時間增長,保證了樣品制備的的重現(xiàn)性,并且可實現(xiàn)多個參數(shù)的檢測。該方法可進一步推進大視場顯微成像的技術(shù)應用于便攜式血細胞計數(shù)的檢測。
【學位單位】：華中師范大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R446.1
【部分圖文】：

ＭＡＳＴＥＲ＇Ｓ?ＴＨＥＳＩＳ??在過去幾十年，診斷技術(shù)已大大改善Ｗ。檢測設(shè)備根據(jù)其尺寸和操作復雜性不??同可分為三大類Ｍ，如圖１．１，第一，醫(yī)院或者中心實驗室分析設(shè)備；第二，較大的??臺式設(shè)備，其本質(zhì)上是尺寸和復雜性降低的實驗室儀器。包括重癥監(jiān)護分析儀、小??型血液分析儀和免疫學分析儀Ｗ。隨著該領(lǐng)域設(shè)備的開發(fā)，未來幾年可能進入商業(yè)??化市場；第三，小型手持設(shè)備，對越來越多的分析物提供定性或定量檢測。應用最??廣泛的技術(shù)是葡萄糖生物傳感器試紙條［９］和使用固定抗體側(cè)向?qū)游觯郏保ǎ輽z測一系列參??數(shù)，包括心臟標志物和感染性病原體等。最終可提供給未經(jīng)任何培訓的人以自動化??的檢測模式提供快速的定性或定量分析。??％?一一?咨?ｍｍ??Ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－ｕｓｅ?ｔ?ＢＨ??Ｂｅｎｃｈ－ｔｏｐ?＾?：??＾?．…＂？?－??ｃ?ｍｍ??Ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－ｕｓｅ?Ｉ?Ｉ?＾??Ｈａｎｄｈｅ，ｄ?＾??圖１．１基于尺寸和便攜性對分析設(shè)備的分類Ｍ。圖ａ表示醫(yī)院或者中心實驗室分析設(shè)備。圖ｂ??表示臺式便攜式分析儀器。圖ｃ表示手持便攜式分析儀器。??ＰＯＣＴ為達到現(xiàn)場即時檢測，通常需要其具有快速、簡單、成本低、便攜、使??用后可丟棄、易處理等特點。具體來說，患者和醫(yī)務人員提供的臨床設(shè)備能夠?qū)崿F(xiàn)??真正的ＰＯＣＴ系統(tǒng)

，ＰＣ。??（１）基于微流控芯片的ＰＯＣ檢測??微流控芯片是一塊微米級別的芯片，橫截面在１?－５００?ｐｍ范圍內(nèi)，用來實現(xiàn)對??生物、化學、醫(yī)用臨床樣本進行分離、富集、分析等過程。微流體領(lǐng)域直到２０世紀??９０年代才獲得大量關(guān)注＠１。最初使用的材料是硅和玻璃，后來發(fā)展到聚合物，特別??是聚二甲基硅氧烷（ＰＤＭＳ）。從此，各種各樣的材料應用于該領(lǐng)域。這些材料大致??分為三大類：無機材料，聚合物和紙張［２１］。在微流體裝置中添加電泳或者泵，為流??體的控制和分離提供了非機械方法，其操作簡便、使用快速并且價格低廉的軟光刻??技術(shù)進一步推進了微流控技術(shù)的發(fā)展［２２］。現(xiàn)在可直接從微流控芯片制造商中如??Ｄｏｌｏｍｉｔｅ獲得商業(yè)微流體系統(tǒng)。??微流體系統(tǒng)具有尺寸小，流通時間短等優(yōu)點。較小的通道尺寸，測試和分析所??需的樣品或試劑量也較少，有利于便攜式設(shè)備進行現(xiàn)場測試（假設(shè)相關(guān)的硬件具有??類似的便攜性）。在微流體裝置中同時集成多個過程（如標記，純化，分離和檢測??等），廣泛運用于單細胞分析、藥物篩選、環(huán)境監(jiān)測和太空探索等多個領(lǐng)域。??Ｆａｎ［２３］報道了一種集成的微流控編碼芯片。如圖１．２，用于微量血液中的蛋白質(zhì)??含量的快速多重分析。該系統(tǒng)采用指尖血，通過Ｚｗｅｉｆａｃｈ－Ｆｕｎｇ效應分離得到血漿，??在血漿通道內(nèi)采用多個ＤＮＡ編碼的抗體進行原位蛋白質(zhì)測量。??

糾學位論文??ＭＡＳＴＥＲ＇ＳＴＨＥＳＩＳ??（２）基于紙基的ＰＯＣ檢測??以紙為分析載體，最早可以追溯到１９世紀近代化學ｐＨ試紙條的使用。２００７年??哈佛大學Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ［２４］組發(fā)明紙質(zhì)微流控芯片后，紙基微流控分析裝置便快速發(fā)展。??現(xiàn)在最常見的紙基檢測產(chǎn)品糖尿病試紙條和驗孕試紙條被大家所公認［２５，２６］。??微流體紙分析設(shè)備，在過去十幾年中蓬勃發(fā)展［２７］。主要具有以下獨特的屬性：??（１）紙張材料便宜且易獲得；（２）材料可以通過簡單處理，對環(huán)境無害；（３）材??料具有易成型和圖案化功能；（４）紙的多孔結(jié)構(gòu)有利于流體的無泵芯吸；（５）紙??具有生物相容性；（６）紙可以通過表面修飾等進行化學改性；（７）通常紙的白色??背景為基于顏色的檢測提供了對比方法呢２９］。試紙條［３（）］、側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l（ＬＦＡ）??［３１，Ｍ和基于紙的分析設(shè)備１２８］已廣泛運用于健康檢測、環(huán)境保護、食品工業(yè)方面分析。??
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本文編號：2862958