第一部分激光響應(yīng)型靶向相變分子探針的制備及性能檢測(cè)目的制備一種激光響應(yīng)型靶向相變分子探針(HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP),檢測(cè)其基本的物理化學(xué)性質(zhì)、體外液氣相變及光熱性能。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP的光熱效應(yīng)及特異靶向HER2陽性乳腺癌細(xì)胞的能力。方法采用雙乳化法聯(lián)合碳二亞胺法制備HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP靶向分子探針,并檢測(cè)其表面形貌、粒徑與電位、紫外吸收光譜、SPIO裝載量等理化性質(zhì)。免疫熒光法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HER2抗體(Herceptin)與分子探針連接率。檢測(cè)DIR-SPIO-PLGA/PFP分子探針在近紅外(NIR)激光激發(fā)下的液氣相變能力及光熱能力。CCK-8法檢測(cè)不同濃度的HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP、DIR-SPIO-PLGA/PFP和Herceptin對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、SKBR3的殺傷作用。NIR激光輻照下,檢測(cè)不同濃度HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、SKBR3的光熱治療效果。激光共聚焦顯微鏡觀察靶向分子探針特異與HER2陽性人乳腺癌細(xì)胞株SKBR3細(xì)胞結(jié)合的能力。結(jié)果通過雙乳化法聯(lián)合碳二亞胺法制備的HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP靶向分子探針為棕褐色乳液,掃描電鏡(Scanning electron microscope,SEM)、透射電鏡(Transmission electron microscope,TEM)顯示該靶向分子探針為殼核結(jié)構(gòu)的納米球。馬爾文粒徑儀檢測(cè)DIR-SPIO-PLGA/PFP和HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP的平均粒徑分別為278±83.29 nm和298±109.5 nm,平均電位分別為-1.78±3.57mV和-2.61±3.53 mV。紫外吸收光譜顯示HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP在764 nm處有吸收峰。電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP-OES)測(cè)量SPIO包封率為93%。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得Herceptin與分子探針連接率為99%,BCA蛋白濃度定量測(cè)得其連接量為0.28 mg/mL。4℃條件下放置7天,HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP粒徑均無明顯變化,反映出良好的穩(wěn)定性。在NIR激光觸發(fā)下,DIR-SPIO-PLGA/PFP可發(fā)生液氣相變,形成微泡。體外光熱實(shí)驗(yàn)顯示DIR-SPIO-PLGA/PFP具有較高的光熱效率,具備用于光熱治療的潛能。HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP、DIR-SPIO-PLGA/PFP和游離的Herceptin對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞均無明顯的細(xì)胞毒性。而HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP和游離的Herceptin隨著濃度增加對(duì)SKBR3細(xì)胞顯示出一定的細(xì)胞毒性。給予激光輻照后,HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP對(duì)SKBR3細(xì)胞顯示出隨濃度提高而增大的細(xì)胞毒性,而對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞無明顯殺傷作用。體外靶向?qū)嶒?yàn)顯示HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP可特異聚集在人乳腺癌SKBR3細(xì)胞膜(HER2陽性)周圍,而較少聚集在人乳腺癌MDA-MB-231(HER2陰性)細(xì)胞膜周圍,進(jìn)一步證實(shí)HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP具有特異靶向HER2陽性細(xì)胞的能力。結(jié)論通過雙乳化法聯(lián)合碳二亞胺法成功地制備了HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP靶向分子探針。該分子探針大小均一、分散性好,SPIO及Herceptin裝載量高,穩(wěn)定性好。同時(shí)具備激光響應(yīng)性液氣相變的能力。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)其靶向HER2陽性乳腺癌細(xì)胞效率高,在NIR激光輻照下可有效殺滅SKBR3細(xì)胞,有望成為用于HER2陽性乳腺癌診療一體化理想的分子探針。第二部分激光響應(yīng)型靶向相變分子探針用于多模態(tài)成像研究目的觀察DIR-SPIO-PLGA/PFP分子探針體外磁共振成像、光聲成像和超聲成像效果;采用裸鼠乳腺癌移植瘤模型觀察HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP在體內(nèi)進(jìn)行磁共振、光聲、超聲及近紅外熒光成像的能力及其原理。方法制備體外凝膠模型,應(yīng)用磁共振掃描儀和光聲成像系統(tǒng)對(duì)不同濃度的DIR-SPIO-PLGA/PFP分別進(jìn)行磁共振和光聲成像并檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度。NIR激光激發(fā)下,采用超聲診斷儀研究DIR-SPIO-PLGA/PFP、PLGA/PFP及生理鹽水的超聲成像效果,并采集灰度信號(hào)。建立裸鼠SKBR3乳腺癌移植瘤模型,當(dāng)腫瘤體積達(dá)到200 mm~3時(shí)進(jìn)行體內(nèi)多模態(tài)成像實(shí)驗(yàn)。把荷瘤裸鼠隨機(jī)分為三組,分別經(jīng)尾靜脈注射HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP、DIR-SPIO-PLGA/PFP和生理鹽水,注射前后各時(shí)間點(diǎn)分別行磁共振、光聲成像,并測(cè)量相應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度。在體內(nèi)超聲成像實(shí)驗(yàn)中,三組荷瘤鼠在尾靜脈給藥6小時(shí)后行NIR激光輻照腫瘤,采集激光輻照前后的超聲圖像及信號(hào)強(qiáng)度。在體內(nèi)近紅外熒光成像實(shí)驗(yàn)中,分別采集隨機(jī)注射不同分子探針后各時(shí)間點(diǎn)荷瘤鼠的熒光圖像并測(cè)量其信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)果體外磁共振成像和光聲成像結(jié)果顯示,DIR-SPIO-PLGA/PFP隨著濃度的增加其磁共振T2*成像和光聲成像可明顯增強(qiáng),且1/T2*信號(hào)和光聲信號(hào)均隨著DIR-SPIO-PLGA/PFP的濃度提高成線性增強(qiáng)關(guān)系。體外超聲成像顯示,DIR-SPIO-PLGA/PFP在激光觸發(fā)前呈稍高回聲,在激光觸發(fā)后超聲B模式和CEUS模式下回聲強(qiáng)度均顯著提高。體內(nèi)乳腺癌成像實(shí)驗(yàn)顯示,尾靜脈注射HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP后,腫瘤部位磁共振、光聲、熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng),在6小時(shí)達(dá)到最高峰。而對(duì)照組裸鼠腫瘤部位未見明顯的磁共振、光聲、熒光信號(hào)。體內(nèi)超聲成像結(jié)果顯示,在給藥6小時(shí)后激光觸發(fā)下,HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP可明顯增強(qiáng)B模式和CEUS模式下的超聲顯影效果,而注射非靶向納米粒DIR-SPIO-PLGA/PFP和生理鹽水的裸鼠其腫瘤部位未見明顯增強(qiáng)的超聲信號(hào)。結(jié)論制備的DIR-SPIO-PLGA/PFP在體外凝膠模型顯示出多模態(tài)顯影的潛能。體內(nèi)乳腺癌移植瘤模型進(jìn)一步展示了HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP可在HER2陽性乳腺癌腫瘤組織中有效富集并多模態(tài)顯影,對(duì)HER2陽性乳腺癌的診斷有一定的應(yīng)用前景。第三部分激光響應(yīng)型靶向相變分子探針治療HER2陽性乳腺癌的實(shí)驗(yàn)研究目的研究HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP聯(lián)合NIR激光治療乳腺癌的效果其相關(guān)機(jī)制。評(píng)估HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP的生物安全性及體內(nèi)分布。方法建立SKBR3乳腺癌移植瘤模型,當(dāng)腫瘤體積長(zhǎng)至200 mm~3時(shí),把荷瘤裸鼠隨機(jī)分成5組:1.HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR組,2.DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR組,3.HER-DIR-PLGA/PFP+NIR組,4.單純激光組,5.HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP組。其中1、2、3、4組,在給藥6小時(shí)后給予NIR激光輻照(2 W/cm~2,10 min),并用紅外熱成像儀記錄腫瘤部位的升溫情況。各組裸鼠均觀察21天,每2-3天監(jiān)測(cè)其腫瘤體積和裸鼠體重。各組處理2天后,每組隨機(jī)處死一只裸鼠采集腫瘤標(biāo)本行HE、PCNA及TUNEL染色,顯微鏡觀測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡情況。為檢測(cè)HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP在腫瘤內(nèi)部滲透距離,將9只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為3組,分別為1.HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR組,2.HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP組,3.HER-DIR-SPIO-PLGA+NIR組。1、3組在給藥6小時(shí)后給予NIR激光輻照(2 W/cm~2,10 min),檢測(cè)各組分子探針在腫瘤部位的滲透距離。為評(píng)估HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP的生物安全性,在各組觀察21天后,處死各組裸鼠收集主要臟器進(jìn)行HE染色,觀察有無形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。取健康昆明鼠尾靜脈注射HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP(10mg/m L,200mL),并在處理后的各時(shí)間點(diǎn)收集血液檢測(cè)肝腎功能及熒光強(qiáng)度。進(jìn)一步采用ICP-OES檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)注射分子探針的荷瘤鼠主要臟器中的Fe含量。結(jié)果體內(nèi)治療結(jié)果顯示,在激光輻照后,HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR組腫瘤部位的溫度迅速上升至54.1℃,能有效破壞腫瘤細(xì)胞。而DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR組腫瘤部位溫度只上升至47.9℃。HER-DIR-PLGA/PFP+NIR組和生理鹽水+NIR組腫瘤部位溫度分別為44.2℃和43.9℃。21天后,觀察各組荷瘤鼠腫瘤體積,無激光輻照的HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP組腫瘤體積增長(zhǎng)了2.9倍,腫瘤生長(zhǎng)未受到明顯的抑制作用。在DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR組,HER-DIR-PLGA/PFP+NIR組和生理鹽水+NIR組,腫瘤體積分別增長(zhǎng)了1.4倍,1.9倍和2.1倍,說明腫瘤生長(zhǎng)受到了一定程度的抑制。而只有HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR組,荷瘤鼠腫瘤生長(zhǎng)被明顯抑制。腫瘤組織HE切片顯示,HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR組腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失,形態(tài)不清,細(xì)胞發(fā)生凝固性壞死。PCNA和TUNEL結(jié)果顯示該組腫瘤組織的增殖指數(shù)較其余幾組顯著降低,凋亡指數(shù)較其余幾組顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P0.05)。免疫組織熒光顯示HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR組大量血管被毀壞,促進(jìn)分子探針?biāo)槠蚰[瘤組織內(nèi)部滲透。而單純HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP組,分子探針主要富集在血管周圍。HER-DIR-SPIO-PLGA+NIR組顯示出中等距離的滲透,說明PFP在激光觸發(fā)下的爆破效應(yīng)為促進(jìn)分子探針向體內(nèi)擴(kuò)散的主要途徑。觀察期內(nèi),所用濃度的HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP對(duì)裸鼠肝、腎功能無明顯影響,各組主要臟器HE染色均未見明顯異常,證實(shí)該高分子探針良好的生物安全性。且該分子探針在體內(nèi)的血液循環(huán)時(shí)間長(zhǎng),主要分布于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)。結(jié)論HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP聯(lián)合NIR激光能有效抑制HER2陽性乳腺腫瘤生長(zhǎng),并具有良好的體內(nèi)生物安全性,為HER2陽性乳腺癌的診療一體化提供一種新方式。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R737.9;R445
【部分圖文】：

圖 1-1 HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP 掃描電鏡圖Fig.1-1 The morphology ofHER-DIR-SPIO-PLGA/PFP under scanningelectron microscope圖 1-2 HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP 透射電鏡圖Fig.1-2 The morphology ofHER-DIR-SPIO-PLGA/PFP undertransmission electron microscope

圖 1-1 HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP 掃描電鏡圖Fig.1-1 The morphology ofHER-DIR-SPIO-PLGA/PFP under scanningelectron microscope圖 1-2 HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP 透射電鏡圖Fig.1-2 The morphology ofHER-DIR-SPIO-PLGA/PFP undertransmission electron microscope

附圖R-DIR-SPIO-PLGA/PFP 掃描電鏡The morphology of-SPIO-PLGA/PFP under scanningicroscope圖 1-2 HER-DIR-SPIO-PLGA/PF圖Fig.1-2 The morpholoHER-DIR-SPIO-PLGA/PFP transmission electron microscope
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本文編號(hào)：2860430