第一部分激光響應型靶向相變分子探針的制備及性能檢測目的制備一種激光響應型靶向相變分子探針(HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP),檢測其基本的物理化學性質(zhì)、體外液氣相變及光熱性能。細胞實驗觀察HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP的光熱效應及特異靶向HER2陽性乳腺癌細胞的能力。方法采用雙乳化法聯(lián)合碳二亞胺法制備HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP靶向分子探針,并檢測其表面形貌、粒徑與電位、紫外吸收光譜、SPIO裝載量等理化性質(zhì)。免疫熒光法及流式細胞術(shù)檢測HER2抗體(Herceptin)與分子探針連接率。檢測DIR-SPIO-PLGA/PFP分子探針在近紅外(NIR)激光激發(fā)下的液氣相變能力及光熱能力。CCK-8法檢測不同濃度的HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP、DIR-SPIO-PLGA/PFP和Herceptin對乳腺癌細胞株MDA-MB-231、SKBR3的殺傷作用。NIR激光輻照下,檢測不同濃度HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP對乳腺癌細胞株MDA-MB-231、SKBR3的光熱治療效果。激光共聚焦顯微鏡觀察靶向分子探針特異與HER2陽性人乳腺癌細胞株SKBR3細胞結(jié)合的能力。結(jié)果通過雙乳化法聯(lián)合碳二亞胺法制備的HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP靶向分子探針為棕褐色乳液,掃描電鏡(Scanning electron microscope,SEM)、透射電鏡(Transmission electron microscope,TEM)顯示該靶向分子探針為殼核結(jié)構(gòu)的納米球。馬爾文粒徑儀檢測DIR-SPIO-PLGA/PFP和HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP的平均粒徑分別為278±83.29 nm和298±109.5 nm,平均電位分別為-1.78±3.57mV和-2.61±3.53 mV。紫外吸收光譜顯示HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP在764 nm處有吸收峰。電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP-OES)測量SPIO包封率為93%。流式細胞術(shù)測得Herceptin與分子探針連接率為99%,BCA蛋白濃度定量測得其連接量為0.28 mg/mL。4℃條件下放置7天,HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP粒徑均無明顯變化,反映出良好的穩(wěn)定性。在NIR激光觸發(fā)下,DIR-SPIO-PLGA/PFP可發(fā)生液氣相變,形成微泡。體外光熱實驗顯示DIR-SPIO-PLGA/PFP具有較高的光熱效率,具備用于光熱治療的潛能。HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP、DIR-SPIO-PLGA/PFP和游離的Herceptin對乳腺癌MDA-MB-231細胞均無明顯的細胞毒性。而HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP和游離的Herceptin隨著濃度增加對SKBR3細胞顯示出一定的細胞毒性。給予激光輻照后,HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP對SKBR3細胞顯示出隨濃度提高而增大的細胞毒性,而對MDA-MB-231細胞無明顯殺傷作用。體外靶向?qū)嶒烇@示HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP可特異聚集在人乳腺癌SKBR3細胞膜(HER2陽性)周圍,而較少聚集在人乳腺癌MDA-MB-231(HER2陰性)細胞膜周圍,進一步證實HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP具有特異靶向HER2陽性細胞的能力。結(jié)論通過雙乳化法聯(lián)合碳二亞胺法成功地制備了HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP靶向分子探針。該分子探針大小均一、分散性好,SPIO及Herceptin裝載量高,穩(wěn)定性好。同時具備激光響應性液氣相變的能力。細胞實驗證實其靶向HER2陽性乳腺癌細胞效率高,在NIR激光輻照下可有效殺滅SKBR3細胞,有望成為用于HER2陽性乳腺癌診療一體化理想的分子探針。第二部分激光響應型靶向相變分子探針用于多模態(tài)成像研究目的觀察DIR-SPIO-PLGA/PFP分子探針體外磁共振成像、光聲成像和超聲成像效果;采用裸鼠乳腺癌移植瘤模型觀察HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP在體內(nèi)進行磁共振、光聲、超聲及近紅外熒光成像的能力及其原理。方法制備體外凝膠模型,應用磁共振掃描儀和光聲成像系統(tǒng)對不同濃度的DIR-SPIO-PLGA/PFP分別進行磁共振和光聲成像并檢測信號強度。NIR激光激發(fā)下,采用超聲診斷儀研究DIR-SPIO-PLGA/PFP、PLGA/PFP及生理鹽水的超聲成像效果,并采集灰度信號。建立裸鼠SKBR3乳腺癌移植瘤模型,當腫瘤體積達到200 mm~3時進行體內(nèi)多模態(tài)成像實驗。把荷瘤裸鼠隨機分為三組,分別經(jīng)尾靜脈注射HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP、DIR-SPIO-PLGA/PFP和生理鹽水,注射前后各時間點分別行磁共振、光聲成像,并測量相應的信號強度。在體內(nèi)超聲成像實驗中,三組荷瘤鼠在尾靜脈給藥6小時后行NIR激光輻照腫瘤,采集激光輻照前后的超聲圖像及信號強度。在體內(nèi)近紅外熒光成像實驗中,分別采集隨機注射不同分子探針后各時間點荷瘤鼠的熒光圖像并測量其信號強度。結(jié)果體外磁共振成像和光聲成像結(jié)果顯示,DIR-SPIO-PLGA/PFP隨著濃度的增加其磁共振T2*成像和光聲成像可明顯增強,且1/T2*信號和光聲信號均隨著DIR-SPIO-PLGA/PFP的濃度提高成線性增強關(guān)系。體外超聲成像顯示,DIR-SPIO-PLGA/PFP在激光觸發(fā)前呈稍高回聲,在激光觸發(fā)后超聲B模式和CEUS模式下回聲強度均顯著提高。體內(nèi)乳腺癌成像實驗顯示,尾靜脈注射HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP后,腫瘤部位磁共振、光聲、熒光信號逐漸增強,在6小時達到最高峰。而對照組裸鼠腫瘤部位未見明顯的磁共振、光聲、熒光信號。體內(nèi)超聲成像結(jié)果顯示,在給藥6小時后激光觸發(fā)下,HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP可明顯增強B模式和CEUS模式下的超聲顯影效果,而注射非靶向納米粒DIR-SPIO-PLGA/PFP和生理鹽水的裸鼠其腫瘤部位未見明顯增強的超聲信號。結(jié)論制備的DIR-SPIO-PLGA/PFP在體外凝膠模型顯示出多模態(tài)顯影的潛能。體內(nèi)乳腺癌移植瘤模型進一步展示了HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP可在HER2陽性乳腺癌腫瘤組織中有效富集并多模態(tài)顯影,對HER2陽性乳腺癌的診斷有一定的應用前景。第三部分激光響應型靶向相變分子探針治療HER2陽性乳腺癌的實驗研究目的研究HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP聯(lián)合NIR激光治療乳腺癌的效果其相關(guān)機制。評估HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP的生物安全性及體內(nèi)分布。方法建立SKBR3乳腺癌移植瘤模型,當腫瘤體積長至200 mm~3時,把荷瘤裸鼠隨機分成5組:1.HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR組,2.DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR組,3.HER-DIR-PLGA/PFP+NIR組,4.單純激光組,5.HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP組。其中1、2、3、4組,在給藥6小時后給予NIR激光輻照(2 W/cm~2,10 min),并用紅外熱成像儀記錄腫瘤部位的升溫情況。各組裸鼠均觀察21天,每2-3天監(jiān)測其腫瘤體積和裸鼠體重。各組處理2天后,每組隨機處死一只裸鼠采集腫瘤標本行HE、PCNA及TUNEL染色,顯微鏡觀測腫瘤細胞的增殖和凋亡情況。為檢測HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP在腫瘤內(nèi)部滲透距離,將9只荷瘤裸鼠隨機分為3組,分別為1.HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR組,2.HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP組,3.HER-DIR-SPIO-PLGA+NIR組。1、3組在給藥6小時后給予NIR激光輻照(2 W/cm~2,10 min),檢測各組分子探針在腫瘤部位的滲透距離。為評估HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP的生物安全性,在各組觀察21天后,處死各組裸鼠收集主要臟器進行HE染色,觀察有無形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。取健康昆明鼠尾靜脈注射HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP(10mg/m L,200mL),并在處理后的各時間點收集血液檢測肝腎功能及熒光強度。進一步采用ICP-OES檢測各時間點注射分子探針的荷瘤鼠主要臟器中的Fe含量。結(jié)果體內(nèi)治療結(jié)果顯示,在激光輻照后,HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR組腫瘤部位的溫度迅速上升至54.1℃,能有效破壞腫瘤細胞。而DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR組腫瘤部位溫度只上升至47.9℃。HER-DIR-PLGA/PFP+NIR組和生理鹽水+NIR組腫瘤部位溫度分別為44.2℃和43.9℃。21天后,觀察各組荷瘤鼠腫瘤體積,無激光輻照的HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP組腫瘤體積增長了2.9倍,腫瘤生長未受到明顯的抑制作用。在DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR組,HER-DIR-PLGA/PFP+NIR組和生理鹽水+NIR組,腫瘤體積分別增長了1.4倍,1.9倍和2.1倍,說明腫瘤生長受到了一定程度的抑制。而只有HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR組,荷瘤鼠腫瘤生長被明顯抑制。腫瘤組織HE切片顯示,HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR組腫瘤細胞結(jié)構(gòu)消失,形態(tài)不清,細胞發(fā)生凝固性壞死。PCNA和TUNEL結(jié)果顯示該組腫瘤組織的增殖指數(shù)較其余幾組顯著降低,凋亡指數(shù)較其余幾組顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(*P0.05)。免疫組織熒光顯示HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR組大量血管被毀壞,促進分子探針碎片向腫瘤組織內(nèi)部滲透。而單純HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP組,分子探針主要富集在血管周圍。HER-DIR-SPIO-PLGA+NIR組顯示出中等距離的滲透,說明PFP在激光觸發(fā)下的爆破效應為促進分子探針向體內(nèi)擴散的主要途徑。觀察期內(nèi),所用濃度的HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP對裸鼠肝、腎功能無明顯影響,各組主要臟器HE染色均未見明顯異常,證實該高分子探針良好的生物安全性。且該分子探針在體內(nèi)的血液循環(huán)時間長,主要分布于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)。結(jié)論HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP聯(lián)合NIR激光能有效抑制HER2陽性乳腺腫瘤生長,并具有良好的體內(nèi)生物安全性,為HER2陽性乳腺癌的診療一體化提供一種新方式。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R737.9;R445
【部分圖文】：

圖 1-1 HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP 掃描電鏡圖Fig.1-1 The morphology ofHER-DIR-SPIO-PLGA/PFP under scanningelectron microscope圖 1-2 HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP 透射電鏡圖Fig.1-2 The morphology ofHER-DIR-SPIO-PLGA/PFP undertransmission electron microscope

圖 1-1 HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP 掃描電鏡圖Fig.1-1 The morphology ofHER-DIR-SPIO-PLGA/PFP under scanningelectron microscope圖 1-2 HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP 透射電鏡圖Fig.1-2 The morphology ofHER-DIR-SPIO-PLGA/PFP undertransmission electron microscope

附圖R-DIR-SPIO-PLGA/PFP 掃描電鏡The morphology of-SPIO-PLGA/PFP under scanningicroscope圖 1-2 HER-DIR-SPIO-PLGA/PF圖Fig.1-2 The morpholoHER-DIR-SPIO-PLGA/PFP transmission electron microscope
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本文編號：2860430